Cultivo de bacterias de muestras sólidas, líquidas y de hisopo (con la figura)

Propósito:

Los principales propósitos del cultivo de bacterias son los siguientes:

1. Aumentar el número de bacterias, para obtenerlas en formas visibles, como colonias o suspensiones.

2. Aislamiento de bacterias.

3. Mantenimiento de la cultura de stock puro y cultivos estándar.

4. Enumeración de bacterias en muestras.

5. Detección de bacterias particulares de interés en una muestra y su enumeración.

6. Identificación de bacterias a partir de las características de las colonias, características de crecimiento en inclinaciones y actividades bioquímicas en diferentes medios.

Sin embargo, el propósito de este experimento es solo cultivar bacterias de muestras líquidas, sólidas y de superficie en medios sólidos y líquidos, para obtenerlas en formas visibles como colonias o suspensiones, respectivamente.

Principio:

Las bacterias se cultivan en medios líquidos o sólidos esterilizados y nutritivamente ricos. El medio líquido, llamado caldo, está contenido en tubos de ensayo para formar "tubos de caldo", mientras que el medio sólido, llamado medio de agar, está contenido en placas de Petri para formar "placas de agar" o simplemente "placas". El cultivo de bacterias necesita algún material, que se sospecha que contiene bacterias.

La mayoría de las cosas que vemos contienen bacterias. Están presentes en raspaduras, alimentos, suelo, agua, materia fecal e incluso en los medios microbiológicos no esterilizados. Una cantidad definida de la suspensión homogénea de cualquiera de los materiales que contienen bacterias se inocula en el medio esterilizado asépticamente y se incuba en una incubadora a 37 ° C durante 24 horas.

En el caldo líquido, las bacterias crecen como suspensión y lo hacen turbio. En placas de agar sólido, crecen como colonias; Cada colonia crece a partir de una sola bacteria. El cultivo de bacterias se realiza en los siguientes cinco pasos.

1. Preparación de los medios de comunicación.

2. Esterilización de medios y productos de vidrio.

3. Inoculación

4. Incubación

5. Observación

1. Preparación de los medios de comunicación:

Generalmente, en la preparación de caldo líquido y medios semisólidos, los ingredientes se pesan en las proporciones prescritas y se disuelven en la cantidad requerida de agua. Actualmente, se encuentran disponibles polvos de medios preparados que contienen los ingredientes en las proporciones requeridas.

En la preparación de caldo líquido, la cantidad prescrita de polvo (como se menciona en la etiqueta del envase) se pesa y se disuelve en la cantidad requerida de agua en un matraz cónico. Los ingredientes se disuelven por calentamiento, se vierten en tubos de ensayo y se esterilizan en autoclave.

Pero en la preparación de placas sólidas, tubos inclinados y tubos profundos, la cantidad prescrita de polvo (como se menciona en la etiqueta del paquete) se pesa y se disuelve en la cantidad requerida de agua en un matraz cónico. Este medio preparado se esteriliza primero en autoclave y luego se deja enfriar durante algún tiempo.

Mientras aún está caliente, antes de que se solidifique, se vierte en placas de Petri o tubos de ensayo esterilizados y se deja solidificar al enfriar a temperatura ambiente. Los medios, en condiciones de mucho calor, nunca deben verterse en recipientes, ya que conducen a la condensación de agua en la pared de los recipientes, que caen sobre la superficie de los medios y pueden provocar su contaminación.

2. Esterilización:

Los artículos de vidrio se esterilizan en un horno de aire caliente a 180 ° C durante 3 horas y los medios en autoclave a 121 ° C (presión de 15 psi) durante 15 minutos. Los artículos de vidrio también pueden esterilizarse en autoclave, pero los medios nunca deben esterilizarse en el horno, ya que el agua se escapa de los medios y se deshidratan.

3. Inoculación:

Se asume que las muestras líquidas son suspensiones homogéneas de bacterias. Por lo tanto, para el cultivo en caldo, se pipetea asépticamente un volumen definido de la muestra en el caldo. Para el cultivo en placas de agar, se pipetea un volumen definido de la muestra sobre la placa de agar sólido y se extiende asépticamente sobre la superficie del medio.

Para muestras sólidas, una muestra de peso definido se homogeneiza asépticamente en un volumen definido de solución salina fisiológica normal (0, 85% de cloruro de sodio) utilizando un mortero y un mortero esterilizados o una licuadora. La mayoría de los patógenos humanos son isotónicos para el cuerpo humano (0, 85% de cloruro de sodio).

Por lo general, la relación de muestra a solución salina es de 1: 9 (1 g + 9 ml; 10 g + 90 ml; 25 g + 225 ml o 50 g + 450 ml). Un volumen definido de este líquido homogeneizado, que se supone que es una suspensión homogénea de bacterias, se pipetea de forma aséptica al caldo esterilizado en tubos de ensayo para cultivo en caldo. Para el cultivo en placas de agar, la suspensión líquida se pipetea sobre la superficie de las placas y se extiende asépticamente.

Para las muestras de superficie tomadas para estudiar la microbiología de superficies sólidas (superficies de mesas, superficies corporales o heridas), la superficie se frota con un hisopo esterilizado. El hisopo se toca la superficie de una placa de agar esterilizada. Desde el punto de contacto, las estrías se hacen asépticamente mediante un asa esterilizada, para aislar las bacterias.

4. Incubación:

Los tubos y placas de caldo inoculados se incuban a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora.

5. Observación:

La turbidez en el caldo líquido y las colonias en placas de agar indican el crecimiento de bacterias.

Material requerido:

Placas de Petri (6 nn.), Pipetas de 2 ml (5 nn.), Tubos de ensayo (5 nn.), Matraces cónicos (100 ml, 250 ml y 500 ml-l cada uno), vaso de precipitados de 250 ml (2 nudos), vaso esparcidor, estuche de pipeta de acero inoxidable, papel para manualidades, hilo (o banda elástica), algodón no absorbente, bastoncillos, asa, alcohol etílico, cloruro de sodio (NaCl), ácido clorhídrico (HCl) 0.1N, hidróxido de sodio 0.1N (NaOH) ), agua destilada, caldo nutritivo, agar nutriente, muestra líquida (por ejemplo, agua de estanque), muestra sólida (por ejemplo, suelo), muestra de superficie (por ejemplo, superficie de mesa, superficie del cuerpo, herida), papel de pH (o medidor de pH), mano de obra y mortero (u homogeneizador), mechero Bunsen, horno de aire caliente, autoclave, incubadora, cámara de flujo laminar.

Procedimiento:

1. Cinco pipetas (en una caja de pipetas de acero inoxidable), seis placas de Petri y un par de mano de mortero y mortero (o una taza de homogeneizador) se esterilizan a 180 ° C durante 3 horas en un horno de aire caliente. Alternativamente, pueden cubrirse con papel artesanal, atarse con hilo o banda de goma y esterilizarse en autoclave junto con el medio (Figura 6.1).

2. Se disuelven 0, 85 g de NaCl en 100 ml de agua destilada en un vaso de precipitados de 250 ml y 90 ml de esta solución salina se vierten en un matraz cónico de 100 ml. La boca está tapada con algodón, cubierta con papel artesanal y atada con hilo o banda de goma.

3. Se pesan los ingredientes del medio de caldo nutritivo requerido para 100 ml del caldo. Alternativamente, se pesa la cantidad prescrita de caldo en polvo ya preparado (mezcla de ingredientes).

4. Los ingredientes (o el polvo ya preparado) se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando. Su pH se determina utilizando un papel de pH o un medidor de pH. El pH se ajusta a 7.0 usando HCl 0.1N si es más o usando NaOH 0.1 N si es menos. El matraz se calienta, si es necesario, para disolver los ingredientes por completo.

5. El caldo se distribuye en 5 tubos de ensayo (aproximadamente 10 ml cada uno), con la boca tapada con algodón, cubierta con papel artesanal y atada con hilo o banda de goma.

6. Los ingredientes del medio de agar nutriente o su polvo listo para usar requerido para 200 ml del medio se pesan y se disuelven en 200 ml de agua destilada en un matraz cónico de 500 ml agitando y agitando.

Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.0 usando 0.1N HCl si es más o usando 0.1 N NaOH si es menos. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente. Luego, se tapa con algodón, se cubre con papel artesanal y se ata con hilo o banda de goma.

7. Los hisopos se hacen girando el algodón alrededor de las puntas de los palitos pequeños. Pocos de estos hisopos se guardan en un tubo de ensayo con las puntas de algodón hacia abajo. El tubo de ensayo está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

8. El matraz cónico de 100 ml con solución salina de 90 ml, los 5 tubos de ensayo con caldo nutritivo, el matraz cónico de 500 ml que contiene 200 ml de medio de agar nutriente y el tubo de ensayo que contiene los hisopos se esterilizan a 121 ° C (presión de 15 psi) para 15 minutos en autoclave.

9. Después de la esterilización, los materiales esterilizados se retiran del autoclave y se dejan enfriar durante algún tiempo, sin permitir que el medio se solidifique. El enfriamiento del medio evita la condensación y la acumulación de gotas de agua dentro de las placas. Si el medio ya ha sido preparado y solidificado durante el almacenamiento, debe licuarse calentándolo cuidadosamente hasta que se derrita por completo.

10. Para preparar las placas de agar nutritivo, antes de que el medio de agar nutriente esterilizado se enfríe y solidifique, en estado fundido caliente, se vierte asépticamente en las 6 placas petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada una), de modo que el medio fundido cubra el fondo de Las placas de petri completamente.

Luego, las placas se cubren con sus tapas y se dejan enfriar, para solidificar el medio en ellas. El vapor de agua que puede condensarse en la superficie interna de las placas y tapas se evapora manteniendo las placas y las tapas en posición invertida en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.

11. Se toma la muestra líquida (se sospecha que contiene bacterias, por ejemplo, agua de estanque). Un ml de cada una de las muestras se pipetea asépticamente en 2 tubos de caldo (Figura 6.2). Los tubos se arremolinan. La muestra líquida también se pipetea de forma aséptica en 2 placas de agar, 0, 1 ml cada una, y se extiende sobre la superficie del medio de agar utilizando un esparcidor de vidrio esterilizado por llama.

Antes de que el esparcidor de vidrio se extienda, se sumerge en alcohol y se flamea sobre un mechero Bunsen. Los tubos y placas de caldo inoculados se incuban a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora. Las placas se incuban en posición invertida, de arriba abajo.

12. Para la muestra sólida (p. Ej. Suelo), 10 g de la muestra se pesan asépticamente y se homogeneizan en el mortero esterilizado o en el vaso de homogeneización después de agregar 90 ml de solución salina esterilizada del matraz cónico de 100 ml.

Esta suspensión de bacterias homogéneas se pipetea asépticamente en 2 tubos de caldo y 2 placas de agar como en el paso 11 y se incuba a 37 ° C durante 24 horas en la incubadora (Figura 6.2). Las placas se incuban en posición invertida, de arriba abajo.

13. Para el muestreo de la superficie, la superficie que se sospecha que contiene bacterias (superficie de la mesa, superficie del cuerpo, herida) está marcada para un área unitaria (por ejemplo, 1 cm ² ), que se frota con un hisopo esterilizado. El hisopo se toca sobre la superficie de las dos placas de agar que quedan fuera.

La estría se realiza de forma aséptica mediante un bucle esterilizado por llama. Para las rayas, las líneas casi paralelas son dibujadas por el bucle desde el punto de toque de hisopo. Estos forman las vetas primarias. Después de la esterilización por llama del bucle, las rayas secundarias se dibujan casi en diagonal hacia las rayas primarias. De manera similar, las estrías terciarias y cuaternarias se hacen asépticamente.

14. Luego, las placas se incuban en posición invertida, de arriba abajo, a 37 ° C durante 24 horas en la incubadora (Figura 6.2).

15. Una placa de agar no inoculada y un tubo de caldo no inoculado se incuban como control para garantizar una esterilización adecuada, según lo indicado por el crecimiento en ellos. Este paso es opcional.