Inmunodifusión de antígenos o anticuerpos
Inmunodifusión de antígeno o anticuerpos!
La inmunodifusión se refiere al movimiento de antígeno o anticuerpo o moléculas de antígeno y anticuerpo en un medio de soporte por difusión.
El antígeno y el anticuerpo se unen entre sí y forman un inmunoprecipitado insoluble, que es visible a simple vista como una banda o línea de precipitina. J. Oudin describió un sistema de difusión única de antígeno y anticuerpo en tubos llenos de agar.
Pronto Ouchterlony describió la doble difusión en el agar, en capas sobre los portaobjetos. El movimiento también se describe como lineal o radial. Los métodos de inmunodifusión se utilizan para el análisis cualitativo y cuantitativo de proteínas séricas. Sin embargo, los métodos más sensibles y específicos como el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y el radioinmunoensayo (RIA) casi han reemplazado a los métodos de inmunodifusión.
Inmunodifusión única:
El antígeno o el anticuerpo permanecen fijos y el otro reactivo se mueve (técnica de difusión de Oudin).
Doble Inmunodifusión:
Tanto el antígeno como el anticuerpo son libres de moverse uno hacia el otro. (Técnica de Ouchterlony).
El agar fundido se vierte en un portaobjetos de vidrio o petrificado y se deja solidificar. Se perforan dos pequeños pozos a una distancia de unos pocos milímetros. Las soluciones de antígeno y anticuerpo correspondiente se colocan en pocillos opuestos. El portaobjetos / petridish luego se mantiene en una cámara húmeda durante 18-24 horas. El antígeno y el anticuerpo se mueven a través del agar y se combinan para formar un complejo antígeno-anticuerpo. El complejo antígeno-anticuerpo es visible como una línea de precipitación.
La doble difusión también se realiza colocando los pocillos de antígeno y anticuerpo en varios ángulos con fines comparativos. Los tres patrones de estas reacciones se muestran en la Figura 27.2.
yo. Reacción de identidad:
Los antígenos en dos pocillos son idénticos (Agl y Ag2). Así que la reacción con el anticuerpo da como resultado líneas de precipitina precisamente similares. Las líneas de precipitación no se cruzan, sino que forman una línea continua. La fusión de las dos líneas de precipitación indica que el anticuerpo está reaccionando con los epítopos comúnmente presentes en los dos antígenos.
ii. Reacción de no identidad:
Dos antígenos no idénticos (Agl y Ag3) están en los pocillos de antígenos, mientras que el anticuerpo tiene anticuerpos contra ambos antígenos. Las dos líneas de precipitina antígeno-anticuerpo formadas difieren entre sí. Por lo tanto, las dos líneas de precipitación se cruzan completamente (se cruzan) entre sí.
iii. Reacción de identidad parcial:
Los determinantes antigénicos en los antígenos de dos pozos están parcialmente compartidos (Agl y Agla). Por lo tanto, el anticuerpo reacciona con ambos antígenos y forma líneas que no forman una cruz completa. La línea de precipitación se cruza en una sola dirección. La línea de precipitación extendida se conoce como espolón. El espolón indica que el anticuerpo también está precipitando un epítope adicional que no está presente en uno de los antígenos.
La doble inmunodifusión también se puede usar para el análisis semicuantitativo de antígeno o anticuerpo (Fig. 27.3):
Fig. 27.3:
Doble inmunodifusión para análisis semicuantitativo de antígeno. El anticuerpo se coloca en el pozo central y el antígeno se coloca en diferentes concentraciones en los pozos periféricos
yo. Cuantificación de antígeno:
El antígeno X se diluye en serie y se coloca en los pozos que rodean un pozo central en el que se coloca el anticuerpo anti-X. El antígeno y el anticuerpo se difunden fuera de los pocillos y reaccionan entre sí, dando como resultado la formación de líneas de precipitina entre los pocillos de antígeno y anticuerpo. La cantidad de precipitado antígeno-anticuerpo disminuye con cantidades decrecientes de antígenos en los diferentes pozos. Por lo tanto, el grosor de las líneas de precipitación disminuye a medida que disminuyen las concentraciones de antígeno.
ii. Cuantificación del anticuerpo:
Se utiliza un procedimiento similar a la cuantificación del antígeno, excepto que se cambia la posición del antígeno y el anticuerpo. El antígeno se coloca en el pozo central y el anticuerpo a diferentes diluciones se coloca en los pocillos externos.
Inmunodifusión radial única:
Mancini introdujo esta nueva técnica para la cuantificación precisa de antígenos. El anticuerpo se mezcla con agar fundido y se vierte en una placa de Petri. Después de la solidificación del agar, los pocillos se cortan y se llenan con diferentes concentraciones de antígeno (Fig. 27.4).
El antígeno se difunde fuera del pozo y forma el precipitado del complejo antígeno-anticuerpo en 48-72 horas. El precipitado se ve como una línea circular blanca alrededor de cada pozo. El diámetro del anillo circular es directamente proporcional a la concentración de antígeno (es decir, más la concentración de antígeno, más el diámetro del precipitado).
Se puede trazar una curva estándar en una hoja gráfica graficando las concentraciones de antígeno conocidas en el eje X y los diámetros en el eje Y. El antígeno de prueba, cuya concentración se desconoce, se puede determinar mediante la interpolación de la curva estándar con el diámetro del precipitado formado por el antígeno de prueba.
La sensibilidad de este método es de 1-3 µg / ml de antígeno. Este método se utiliza para cuantificar las concentraciones de IgG, IgM o IgA (incorporando en el agar antisueros anti-IgG, anti-IgM o anti-IgA, respectivamente).
