Western blotting de proteínas
Western Blotting de proteínas!
Las proteínas se desnaturalizan mediante incubación con un detergente iónico (SDS: dodecil sulfato de sodio) a 100 ° C.
SDS recubre uniformemente todas las proteínas y hace que la carga superficial de las proteínas sea negativa.
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La proteína desnaturalizada se electroforiza en gel de poliacrilamida. Las proteínas se separan como bandas distintas dependiendo de sus pesos moleculares.
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Las proteínas separadas se transfieren electroforéticamente a un papel de filtro (nailon o nitrocelulosa).
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El papel de filtro se incuba con antisueros contra las proteínas. Los anticuerpos se unen a sus antígenos proteicos correspondientes en el papel de filtro y forman complejos antígeno-anticuerpo.
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El papel de filtro se lava para eliminar los componentes de suero no unidos.
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La enzima marcada anti-inmunoglobulina (conocida como conjugado) se agrega al papel de filtro y se incuba.
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El conjugado se une al anticuerpo en el complejo antígeno-anticuerpo en el papel de filtro.
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El papel de filtro se lava para eliminar el conjugado no unido y el sustrato se agrega y se incuba.
yo. Las bandas coloreadas se desarrollan en lugares donde hay complejos antígeno-anticuerpo.
iii. El no desarrollo de la banda sugiere que el anticuerpo correspondiente contra el antígeno está ausente en el suero de prueba.
Los papeles de filtro impregnados con antígenos se pueden almacenar por períodos más largos.
El análisis de Western blot se usa ampliamente para detectar anticuerpos contra el virus de la hepatitis C y como prueba confirmatoria para la detección de anticuerpos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Las empresas comerciales impregnan los papeles de filtro con antígenos del VIH separados y los suministran a los laboratorios. En el laboratorio, el suero del paciente se agrega al papel de filtro y se procesa para detectar la presencia de anticuerpos específicos del VIH en el suero.
Radioinmunoanálisis:
El radioinmunoensayo (RIA) fue desarrollado por primera vez por Rosalin Yalow y Berson (1959). Se han introducido numerosas variaciones en el método. Hay dos técnicas principales de RIA, RIA competitiva y RIA no competitiva.
Se utilizan diferentes radioisótopos como etiquetas (Tabla 27.4) y las emisiones radiactivas se miden en términos de conteos por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo. La etiqueta más popular, 125 I requiere un tiempo más corto para el conteo de señales, pero tiene una vida útil limitada debido a su corta vida media. El radioisótopo de tritio ( 3 H) requiere más tiempo para el conteo y, por lo tanto, aumenta el tiempo total del ensayo.
Las ventajas de RIA son:
yo. Precisión y alta calidad.
ii. La conjugación de isótopos es fácil.
iii. Detección de señal sin optimización.
Tabla 27.4: Propiedades de los radioisótopos utilizados en el radioinmunoensayo:
Isótopo | Media vida | Tipo de decaimiento | Actividad específica (mCi / µmol) |
125 I | 60 días | γ | 2200 |
131 I | 8.1 días | Β-, γ | 16, 100 |
3 H | 12.3 años | β- | 29 |
14 C | 5760 años | β- | 6062 |
32 p | 14.3 días | β- | 9120 |
Sin embargo, RIA tiene las siguientes desventajas
yo. Corta vida media de los reactivos.
ii. Peligros de la radiactividad.
