Ensayos de función de neutrófilos
Ensayos de función de neutrófilos!
1. La quimiotaxis de los neutrófilos se puede evaluar mediante los siguientes métodos:
a. Ensayo de cámara de Boyden modificado:
La cámara de Boyden consiste en una cámara superior y otra inferior separadas por un filtro con un tamaño de poro pequeño.
La suspensión de neutrófilos se coloca en la cámara superior y una sustancia quimiotáctica se coloca en la cámara inferior. La extensión de la migración de los neutrófilos se evalúa contando el número de neutrófilos atrapados en el filtro y el número de neutrófilos en la cámara inferior mediante citometría de flujo.
segundo. Los pozos se perforan en un agar semisólido:
La suspensión de neutrófilos, la sustancia quimiotáctica y una sustancia no quimiotáctica se colocan en diferentes pozos. La migración de las células a través del agar semisólido hacia el pozo que contiene la sustancia quimiotáctica se determina microscópicamente. La migración hacia la sustancia no quimiotáctica representa bien el movimiento aleatorio de las células (conocido como quimioquinesia).
2. Fagocitosis de neutrófilos:
Se puede usar una variedad de partículas para evaluar la capacidad fagocítica de los neutrófilos. Las partículas se incuban con neutrófilos y luego se observan microscópicamente para detectar la presencia de partículas dentro de los neutrófilos. Las partículas unidas a la superficie celular se eliminan con tratamiento ácido, de modo que las partículas unidas a la superficie celular no se cuentan como partículas intracelulares.
Las partículas marcadas fluorescentes o radiactivas que permiten el conteo directo de partículas por fagocitos también están disponibles ahora.
3. Determinación de estallido respiratorio y degranulación:
La enfermedad granulomatosa crónica (CGD) es una enfermedad de inmunodeficiencia en la que la muerte intracelular por fagocitos se ve afectada debido a la incapacidad de las células fagocíticas para producir anión superóxido (O 2 - ).
a. Prueba de deslizamiento de Nitroblue tetrazolium (NBT):
NBT es un tinte claro, amarillo, soluble en agua. NBT se reduce a un azul profundo, formazon por O 2 - . Los neutrófilos se activan por tratamiento con PMA o exposición a LPS. Los neutrófilos activados se incuban con NBT. Si los neutrófilos producen O2 -, el NBT se reduce a formazon azul profundo y se visualiza bajo el microscopio. Se puede realizar un ensayo cuantitativo extrayendo el formazon de los neutrófilos y analizando el formazon mediante un espectrofotómetro. Los niños con deficiencia completa de la actividad NADPH oxidasa muestran una deficiencia grave en la prueba NBT. Pero los niños con pérdida parcial de la actividad NADPH oxidasa se detectan mejor mediante un ensayo cuantitativo.
segundo. Ensayo de citometría de flujo utilizando 2'7'-dicloro-fluoresceína (DCF):
El O 2 - formado durante la actividad oxidasa de NADPH se convierte en H 2 O 2 por la enzima superóxido dismutasa. El H 2 O 2 es otro químico microbicida. El H2O2 oxida el compuesto no fluorescente DCF a un compuesto fluorescente, que es detectado por el citómetro de flujo.
Los fagocitos se incuban con DCF y DCF entra en las células.
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Luego los neutrófilos son activados por PMA u otros agentes.
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Luego se analizan las células en el citómetro de flujo. Se determina un aumento en la fluorescencia de los fagocitos.
El citómetro de flujo también permite la determinación cuantitativa de H2O2 producido por células individuales. Por lo tanto, el análisis de citometría de flujo es útil en la detección de defectos parciales en la función de la NADPH oxidasa o en la detección de portadores heterocigotos de la forma ligada al X de CGD.
4. Degranulación de fagocitos:
La desgranulación fagocítica es un proceso de fusión de lisosomas con fagosomas, que conduce a la descarga de los contenidos lisosomales en el fagolisosoma. La desgranulación es un proceso activo y requiere energía. El deterioro de las vías metabólicas normales de los neutrófilos (especialmente, el consumo de oxígeno y el metabolismo de la glucosa a través de la derivación del monofosfato de hexosa) interfiere con la desgranulación; En consecuencia, la muerte intracelular de microbios por los fagocitos se ve afectada.
La desgranulación de los fagocitos en una suspensión puede ser inducida por diversos agentes activadores y compuestos que afectan el citoesqueleto de la célula (como la citocalasina B). Los fagocitos liberan principalmente los gránulos secundarios y terciarios y se miden mediante métodos ELISA.
yo. La lactoferrina (un gránulo de neutrófilos secundario) se utiliza como marcador de la liberación de gránulos secundarios.
ii. La albúmina se analiza como una medida de la liberación de gránulos terciarios.
El ensayo para la liberación de gránulos primarios de los fagocitos se realiza buscando la liberación de gránulos primarios en espacios cerrados. La “fagocitosis frustrada” es un ensayo que se utiliza para evaluar la liberación de gránulos primarios (Fig. 27.7).
Los complejos de inmunoglobulina o inmunocomplejados por calor se fijan a un petrido.
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Los neutrófilos se agregan al petridish y se incuban. A través de sus receptores Fc, los neutrófilos se unen a las regiones Fc de inmunoglobulinas o complejos inmunes agregados por calor. En consecuencia, los neutrófilos intentan fagocitar la inmunoglobulina o complejos inmunes agregados por calor. Pero los neutrófilos no pueden fagocitarlos (porque están fijados a la placa de Petri). En consecuencia, los neutrófilos liberan su contenido granular sobre ellos.
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La tasa de liberación de proteínas granulares primarias, como la mieloperoxidasa o la β-glucoronidasa, se utiliza para estimar la desgranulación. Las deficiencias en la síntesis de gránulos primarios / secundarios también pueden detectarse tiñendo los gránulos intracelulares con mAbs marcados y citometría de flujo.
Matanza bacteriana por los neutrófilos:
Los ensayos microbicidas son difíciles de realizar. Generalmente, los ensayos microbicidas se realizan cuando los ensayos más simples no proporcionan información suficiente.
La cepa de Staphylococcus aureus 502A se usa comúnmente para evaluar la capacidad microbicida de los neutrófilos.
La cepa de Staphylococcus aureus 502A que crece en la fase de registro se incuba con sueros humanos (para proporcionar inmunoglobulina y proteínas del complemento para que actúen como opsoninas).
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Se agregan neutrófilos recién aislados a una concentración de 5-10 bacterias / neutrófilos.
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Después de 30 minutos de incubación, las bacterias que no son envueltas por los neutrófilos se eliminan mediante la adición del medicamento gentamicina. (Gentamidn no entra en los neutrófilos y, por lo tanto, las bacterias fagocitadas permanecen vivas).
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Las partes alícuotas de los neutrófilos se eliminan a intervalos de 30 minutos y se mezclan con agua destilada estéril para lisar los neutrófilos y liberar las bacterias. El número de bacterias viables en cada alícuota se mide por dilución en serie y placas en placas de agar sangre.
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Los resultados se trazan en una gráfica.
yo. Los neutrófilos normales muestran una reducción de dos registros en bacterias intracelulares viables después de una hora de incubación.
ii. Prácticamente no hay matanza por los neutrófilos de pacientes homocigotos con CCD.
iii. Los neutrófilos de los portadores heterogéneos de CGD muestran una destrucción parcial por los neutrófilos.
