Replicación del ADN: Mecanismos de la replicación del ADN

¡Algunos de los modos más importantes de replicación del ADN son los siguientes!

La replicación del ADN en eucariotas es semiconservativa, semi-discontinua y bidireccional en comparación con semiconservadora, bidireccional y continua en procariotas.

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La replicación del ADN ocurre durante la fase S del ciclo celular. Es un proceso complejo de varias etapas que requiere más de una docena de enzimas y factores proteicos. Comienza en un lugar en particular llamado origen de replicación u ori. El ADN bacteriano y viral tiene un único origen de replicación. Funciona como una sola unidad de replicación o replicón.

En el ADN eucariótico hay varios orígenes de replicación. Tiene varios segmentos replicantes o replicones, es decir, multirepliconic. En ausencia de ori, la replicación no ocurrirá. El requisito de un vector para la tecnología de ADN recombinante es obtener el origen de replicación.

La replicación del ADN es energéticamente muy costosa. La principal enzima de la replicación del ADN es la ADN polimerasa dependiente del ADN. La replicación del ADN es bastante rápida. La replicación del ADN de E. coli con 4, 6 x 10 ⁶ pb requiere 19 minutos.

En una tasa promedio de polimerización de bases es de 2000 pb por segundo en cada dirección. La replicación requiere abundante energía que proviene de la descomposición de los trifosfatos de desoxirribonucleótidos.

La replicación se lleva a cabo de la siguiente manera:

1. Activación de desoxirribonucleótidos:

Los desoxirribonucleótidos o los monofosfatos de desoxirribonucleósidos ocurren libremente dentro del nucleoplasma. Son de cuatro tipos: deAMP (monofosfato de desoxiadenosina), deGMP (monofosfato de desoxiguanosina), deCMP (monofosfato de desoxicitidina) y deTMP (monofosfato de desoxitimidina). Primero se fosforilan y se cambian a formas activas que tienen tres residuos de fosfato en lugar de uno. Las enzimas fosforilasas se requieren junto con la energía.

Los nucleótidos fosforilados son deATP (trifosfato de desoxiadenosina), deGTP (trifosfato de deoxiguanosina), deCTP (trifosfato de deoxicitidina) y deTTP (trifosfato de deoxitimidina). Estos trifosfatos de bases sirven para doble propósito. Actúan como sustrato y proporcionan energía para la polimerización de nucleótidos.

2. Exposición de hebras de ADN:

La enzima helicasa (unwindase) actúa sobre el sitio Ori y descomprime (desenrolla) las dos cadenas de ADN destruyendo los enlaces de hidrógeno. Las cadenas separadas se estabilizan por medio de proteínas de unión de cadena sencilla (SS BP) o proteínas estabilizadoras de hélice. El desenrollado crea tensión en la parte desenrollada formando más supercoils. La tensión es liberada por las enzimas topoisomerasas.

Causan mella y resellado de la cadena de ADN. Junto con la topoisomerasa, las bacterias poseen otra enzima llamada ADN girasa que puede introducir supercoils negativos (los trabajadores de más edad creían que la girasa funcionaba tanto para la helicasa como para la topoisomerasa).

Con la ayuda de varias enzimas, ambas hebras de ADN se abren para la replicación. Sin embargo, todo el ADN no se abre en un tramo debido a un requerimiento de energía muy alto. El punto de separación avanza lentamente hacia ambas direcciones. En cada dirección, da la apariencia de una estructura en forma de Y llamada horquilla de replicación (Fig. 6.13 y 6.14).

3. Primer de ARN:

Es esencial para el inicio de nuevas cadenas de ADN. El cebador de ARN es una pequeña hebra de ARN que se sintetiza en el extremo 5 'de la nueva hebra de ADN con la ayuda de la enzima ARN polimerasa específica de ADN llamada primasa. El cebador de ARN se forma en el extremo libre de una hebra y el extremo de la horquilla de la otra hebra. La formación del cebador de ARN constituye la fase de inicio de la síntesis de ADN porque, sin la presencia del cebador de ARN, las polimerasas de ADN no pueden agregar nucleótidos.

Se requiere una enzima más compleja llamada primo, algo en el fago x 174 y en algunos otros sistemas procarióticos. En los eucariotas, la función de la primasa se lleva a cabo por la enzima ADN polimerasa α. Se acumula ~ 10 bases de ARN y 20-30 bases de ADN (Lewin, 2004). Después del inicio de la cadena de nucleótidos, el cebador de ARN se elimina y la brecha se llena con ADN polimerasa I en procariotas y ADN polimerasa β en eucariotas.

4. Polimerasas de ADN:

Los procariotas tienen tres tipos principales de enzimas de síntesis de ADN denominadas ADN polimerasas III, II y I. Todos ellos agregan nucleótidos en la dirección 5 '-> 3' en el tramo 3 '-> 5' de la hebra madre. También poseen 3 '-> 5' actividad exo-nucleasa. Mientras que la ADN polimerasa III está involucrada principalmente en la replicación del ADN (adición y polimerización de nuevas bases), la polimerasa I es una enzima reparadora importante. La polimerasa II es una enzima de reparación menor.

La ADN polimerasa I también tiene 5 -> 3 actividad de exonucleasa. En los eucariotas se encuentran cinco tipos de ADN polimerasas: α, β, γ, δ y ε, pero las tres principales son α, δ y e. La polimerasa 8 está involucrada en la replicación de la cadena principal. La polimerasa puede ayudar en la síntesis de cadenas retrasadas junto con otras funciones. La polimerasa α es la enzima más grande y principal de replicación del ADN. Todas las ADN polimerasas tienen una configuración de agarre de la mano con el pulgar en un lado, los dedos en el otro y la palma como sitio catalítico cóncavo para combinar plantillas y pares de bases.

5. Emparejamiento de base:

Las dos cadenas de ADN separadas en la horquilla de replicación funcionan como plantillas. Los trifosfatos de desoxirribonucleósidos se encuentran opuestos a las bases nitrogenadas de los moldes de ADN expuestos: deTTP opuesto A, deCTP opuesto G, deATP opuesto a T y deGTP opuesto a C.

El ataque nucleofílico separa un pirofosfato (PPi) del trifosfato. Se establecen enlaces fosfodiéster. La hidrólisis del pirofosfato por la enzima pirofosfatasa libera energía. Deoxirribouncleoside trifosfato → Deoxyribouncleoside monophosphate + PPi

La energía se utiliza para establecer enlaces de hidrógeno entre los nucleótidos libres y las bases nitrogenadas de las plantillas.

6. Formación de la cadena:

Requiere ADN polimerasa III (Kornberg, 1956) en procariotas y polimerasa δ / ε en eucariotas. La ADN polimerasa III es una enzima compleja que tiene siete subunidades (a, β, ƍ, ƴ, €, θ, τ). En presencia de Mg2 ⁺, ATP (GTP), TPP y ADN polimerasa III, los nucleótidos adyacentes encontrados unidos a las bases nitrogenadas de cada cadena de ADN de plantilla establecen enlaces fosfodiéster y se unen para formar una cadena de ADN replicada.

A medida que avanza la replicación, las nuevas áreas del dúplex de ADN primario se desenrollan y se separan, de modo que la replicación avanza rápidamente desde el lugar de origen hacia el otro extremo. El cebador de ARN se elimina y la brecha se rellena con nucleótidos complementarios por medio de la ADN polimerasa I. Debido a la apertura secuencial de la doble cadena del ADN y su replicación para formar dos cadenas, la replicación del ADN también se llama duplicación de la cremallera.

Sin embargo, la ADN polimerasa puede polimerizar nucleótidos solo en la dirección 5 '→ 3' en la cadena 3 '-> 5' porque los agrega en el extremo 3 '. Dado que las dos cadenas de ADN se ejecutan en direcciones antiparalelas, las dos plantillas proporcionan diferentes fines para la replicación. La replicación sobre las dos plantillas, por lo tanto, procede en direcciones opuestas. Una hebra con polaridad У -> 5 'forma su hebra complementaria continuamente porque el extremo 3' de esta última está siempre abierto para el alargamiento.

Se llama filamento principal. La replicación es discontinua en la otra plantilla con polaridad 5 ′ → 3 porque solo se puede construir un segmento corto de cadena de ADN en la dirección 5 ′ → 3 debido a la exposición de un pequeño tramo de plantilla a la vez. Los segmentos cortos de ADN replicado se denominan fragmentos de Okazaki (= segmentos de Okasaki; Reiji Okazaki, 1968). Cada uno de ellos tiene 1000-2000 pb en procariotas y 100-200 pb en eucariotas.

También se requiere un cebador de ARN cada vez que se construye un nuevo fragmento de Okazaki. Después de reemplazar el cebador de ARN con desoxirribonucleótidos y su polimerización, los fragmentos de Okazaki se unen mediante la enzima ADN ligasa (Khorana, 1967). La hebra de ADN formada por fragmentos de Okazaki se llama hebra retrasada.

A medida que una hebra crece continuamente mientras que la otra se forma de manera discontinua, la replicación del ADN es semi-discontinua. Dado que la replicación procede bidireccionalmente del origen de la replicación u ori, una hebra principal formará una hebra delantera en un lado y una hebra retrasada en el otro. Lo contrario ocurre en las hebras parentales del otro lado. Esto ayuda a completar la replicación simultáneamente en todo el replicón.

7. Prueba de corrección y reparación del ADN:

A veces se introduce una base incorrecta durante la replicación. La frecuencia es de una en diez mil. La ADN polimerasa III es capaz de sentir lo mismo. Retrocede, elimina la base incorrecta, permite la adición de una base adecuada y luego avanza. Sin embargo, incluso la ADN polimerasa III es incapaz de distinguir el uracilo de la timina, por lo que a menudo se incorpora en lugar de la timina. Este desajuste se corrige mediante una serie de enzimas.

Existe un mecanismo de reparación separado para cualquier daño causado al ADN debido a la mutación, la exposición a los rayos UV o la falta de coincidencia que escapa al mecanismo de lectura de pruebas. Una mella o rotura es causada por una endonucleasa cerca de la región de reparación. La ADN polimerasa I (Komberg, 1969) elimina los nucleótidos mal emparejados o incorrectos si están presentes y sintetiza un reemplazo correcto utilizando la cadena intacta como plantilla. El segmento recién formado está sellado por ADN ligasa.