Ensayos de complemento de antígenos y anticuerpos

Complementos de ensayos de antígenos y anticuerpos!

Se dispone de métodos para determinar con precisión cada uno de los componentes del complemento de las tres vías de activación del complemento y varias enzimas y reguladores del sistema del complemento.

Sin embargo, muchos de los ensayos están disponibles solo en laboratorios de investigación.

Hay dos tipos de ensayos de complemento:

1. Ensayos que miden las proteínas del complemento como antígenos.

2. Ensayos que miden la actividad funcional del complemento.

Los ensayos que miden las proteínas del complemento como antígenos son generalmente fáciles de realizar, baratos, requieren menos tiempo y pueden realizarse en muchos laboratorios. Pero estos ensayos antigénicos no proporcionan información sobre las capacidades funcionales de los componentes del complemento porque estos ensayos de antígenos complementarios detectan tanto los componentes del complemento funcionalmente activos como los productos de degradación del complemento.

yo. En general, los ensayos antigénicos no son tan sensibles como los ensayos funcionales.

ii. Los ensayos antigénicos no detectan niveles bajos de componentes del complemento en ciertos fluidos corporales.

iii. Los ensayos ELISA están disponibles para la medición de productos divididos de componentes o complejos del complemento que se forman durante la activación del complemento.

iv. La activación del complemento a través de la vía clásica se puede medir siguiendo los niveles de C4d y C4 en el suero.

v. La medición ELISA de los complejos C1r-C1s-C1INH proporciona una medida de la activación del complemento a través de la vía clásica.

vi. La activación de una vía alternativa se puede medir mediante el método ELISA mediante la evaluación de los niveles de Bb o complejos C3bBbP en circulación.

vii La activación de la vía clásica o alternativa puede monitorizarse midiendo los niveles de iC3b o la forma soluble del complejo de ataque a la membrana sC5b6789.

viii. Se dispone de kits ELISA para medir la anafilotaxina C3a y C5a en suero o plasma.

Manejo de muestras para ensayos complementarios:

El manejo adecuado de las muestras es crítico para los ensayos funcionales del complemento. Algunos de los componentes del complemento son altamente lábiles.

yo. Para la mayoría de los ensayos funcionales, se prefiere suero, en lugar de plasma, porque los quelantes de calcio (como EDTA, heparina) utilizados para obtener plasma pueden ser anticomplementarios.

ii. Para los ensayos funcionales, la sangre debe coagularse a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos y luego en hielo durante al menos una hora.

iii. Para los ensayos de unión de Clq, la sangre debe coagularse durante 2 horas a temperatura ambiente. El coágulo se bordea y se centrifuga a 0 ° C a 4 ° C durante cinco minutos. Si se sospecha la presencia de anticuerpos contra la crioprecipitación, la formación de coágulos y la centrifugación de la sangre deben realizarse a 37 ° C, ya que se puede producir una fijación del complemento si la muestra se enfría.

iv. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en alícuotas en múltiples volúmenes pequeños y almacenarse inmediatamente a una temperatura de 40 a -80 ° C.

v. Cuando los sueros se transfieren, deben sellarse bien y colocarse en contenedores con grandes cantidades de hielo seco.

Complementos de ensayos funcionales:

Los tampones utilizados en los ensayos funcionales del complemento son críticos porque los cambios en la molaridad y las concentraciones de iones metálicos pueden afectar los valores del título del complemento. Ensayo CH 50 para la ruta del complemento clásico: el ensayo funcional más simple de la ruta clásica mide el complemento hemolítico total.

La ausencia de cualquiera de los componentes del complemento da como resultado un título hemolítico total del complemento (CH 50 ) de cero. Los eritrocitos de oveja se utilizan generalmente como células diana para medir el CH 50 o la actividad funcional de los componentes aislados del complemento. Los RBC de ovejas son más sensibles al anticuerpo y complementan la lisis mediada que los RBC de otras especies.

Ensayo AH 50 para la ruta alternativa del complemento:

Los eritrocitos de conejo se utilizan para medir AH 50 . Los RBC de conejo son sensibles a la lisis independiente de anticuerpos mediada por suero humano.

yo. Los ensayos CH 50 y AH 50 son ensayos de detección excelentes para descartar la deficiencia genética de los componentes del complemento.

ii. La actividad normal de CH 50 con valores reducidos de AH 50 se debe a defectos en la ruta alternativa del complemento.

iii. Las deficiencias en los componentes del complemento terminal resultan en la pérdida de las actividades tanto de CH 50 como de AH 50 .

iv. La deficiencia homocigótica de un componente del complemento anula totalmente el ensayo hemolítico.

El grado de hemólisis está influenciado por muchos factores, como la concentración de eritrocitos, la fragilidad (edad) de los eritrocitos, la cantidad de anticuerpo utilizado para la sensibilización, la naturaleza del anticuerpo (IgG o IgM), la fuerza iónica del sistema de tampón, P H, tiempo de reacción, temperatura y concentraciones de calcio 2+ o magnesio 2+ . El valor para las unidades CH50 en suero humano se calcula de varias maneras, como la ecuación de Von krough.

Medición de la deficiencia funcional de los componentes individuales del complemento:

Cuando la historia y los síntomas de un paciente sugieren una posible deficiencia del componente del complemento, pueden requerirse valoraciones hemolíticas del componente individual. Para producir lisados ​​de eritrocitos, se necesita la presencia y activación de todos los componentes del complemento (C1 - C9). Si falta algún componente, no se produce hemólisis. Se necesitan preparaciones puras de cada uno de los componentes del complemento individual para detectar la ausencia de un componente del complemento en particular en el suero o plasma de un paciente.

Para medir los componentes individuales del complemento, se requieren componentes parcialmente purificados. Sin embargo, la medición de C4 es una excepción, debido a la disponibilidad de suero de cobaya deficiente en C4 (C4D). Los sueros de humanos con deficiencia de C2 y cobayas y conejos con deficiencia de C6 están disponibles en pocos laboratorios.

Los ensayos de complemento funcional del componente individual son sensibles y proporcionan información precisa sobre la actividad de un componente del complemento. Pero la mayoría de estos ensayos se limitan a los laboratorios de investigación.

Medición del componente de complemento individual por análisis de antígeno:

El método más común para cuantificar los componentes del complemento, como C3, C4 y el factor B, es la inmunodifusión radial única. Debe recordarse que todos los ensayos funcionales del complemento pueden ser inhibidos por la acción anti-complementaria del suero (que puede resultar del antígeno). complejos de anticuerpos, heparina, agentes quelantes e inmunoglobulinas agregadas).

Prueba de fijación del complemento:

Cuando hay interacción antígeno-anticuerpo, los componentes del complemento se activan y consumen. Por lo tanto, el consumo de complemento del ensayo in vitro indica la presencia de interacción antígeno-anticuerpo. Este principio se utiliza para detectar y medir antígenos o anticuerpos en la prueba de fijación del complemento.

La prueba se realiza en dos etapas. En la primera etapa, se produce la interacción antígeno-anticuerpo y se consume el complemento. En la segunda etapa, se usa un sistema de indicadores para detectar si el complemento se consume o no en la reacción de la primera etapa.

yo. Si el complemento se consume en la primera etapa, significa que la reacción antígeno-anticuerpo ha ocurrido en la primera etapa.

ii. Si el complemento no se consume, significa que no hubo interacción antígeno-anticuerpo en la primera etapa.

Detección de anticuerpo mediante prueba de fijación de complemento:

Primera etapa:

Se toman concentraciones fijas de antígeno y complemento conocidos (generalmente se usa suero fresco de cobaya como fuente de complemento). El suero que contiene (anticuerpos desconocidos) se agrega y se incuba.

A. Antígeno conocido + complemento + suero (correspondientes anticuerpos presentes). El complemento se consume durante la incubación.

B. Antígeno conocido + complemento -1- suero (ausencia de anticuerpos correspondientes). El complemento no se consume porque el suero no contiene anticuerpos que son específicos del antígeno conocido.

Segunda etapa:

Se añaden a los tubos eritrocitos de oveja recubiertos con anticuerpos de conejo contra los eritrocitos de oveja. En presencia de complemento, los eritrocitos de oveja se lisarán (hemólisis). En ausencia de complemento, los eritrocitos no se lisarán (sin hemólisis).

A. Dado que el complemento se usa durante la primera etapa de la reacción, los eritrocitos de oveja recubiertos con anticuerpos no se lisan. Por lo tanto, la ausencia de hemólisis sugiere que el suero contiene anticuerpos específicos contra el antígeno utilizado en la prueba.

B. Dado que el complemento no se usa en la primera etapa, los eritrocitos de oveja recubiertos con anticuerpos se hemolizan por el complemento en la segunda etapa. Por lo tanto, la presencia de hemólisis sugiere que el suero no contiene anticuerpos específicos contra el antígeno utilizado.

Las pruebas de fijación del complemento son ampliamente utilizadas en laboratorios clínicos e investigación. Los virus, los anticuerpos séricos contra las infecciones virales, los anticuerpos contra Treponema pallidum que causan la sífilis, los anticuerpos antifúngicos (Coccidioidomicosis immitis, Histoplasma capsulatum), los anticuerpos anti- Mycoplasma pneumoniae y los anticuerpos antirriquetes se detectan mediante una prueba de fijación del complemento.