Animales transgénicos: objetivos de la transferencia de genes con diferentes métodos de transfección

Animales transgénicos: ¡Objetivos de la transferencia de genes con diferentes métodos de transfección!

Un animal transgénico contiene en su genoma, un gen o genes introducidos por una u otra técnica de transfección.

El gen introducido por la transfección se llama transgén. En la transfección de animales se especifica la introducción de un segmento de ADN, ya sea desnudo o integrado en un vector, en una célula animal.

Objetivos de la transferencia de genes:

1. La modificación genética de los animales puede tener como objetivo mejorar la producción de leche, carne, lana, etc.

2. Los genes se han transferido a animales para obtener una producción a gran escala de las proteínas codificadas por estos genes en la leche, orina o sangre de dichos animales.

3. Un caso especial de transferencia de genes tiene como objetivo aliviar o incluso eliminar los síntomas y las consecuentes miserias de las enfermedades genéticas. En este enfoque, se introducen copias normales y funcionales del gen defectuoso en el paciente (terapia génica).

4. Se crean líneas o líneas de animales transgénicos específicos para satisfacer necesidades experimentales y / o biomédicas especializadas.

Métodos de transfección:

Se han utilizado varios enfoques para la introducción de ADN en células / embriones animales que son los siguientes:

(i) Precipitación con fosfato de calcio.

(ii) Microinyección directa.

(iii) Infección por retrovirus.

(iv) Lipofección.

(v) Entrega de pistola de partículas y

(vi) Electropoiación.

Precipitación de fosfato de calcio:

En este enfoque, la preparación de ADN que se utilizará para la transfección se disuelve primero en un tampón de fosfato. Luego se agrega solución de cloruro de calcio a la solución de ADN; esto conduce a la formación de fosfato de calcio insoluble que co-precipita con el ADN. El precipitado de fosfato de calcio-ADN se agrega a las células para ser transfectadas.

Las partículas precipitadas son captadas por las células por fagocitosis. Inicialmente, el 1-2% de las células se transfectaron con este enfoque. Pero el procedimiento ahora se ha modificado para obtener la transfección de hasta el 20% de las células. En una pequeña proporción de las células transfectadas, el ADN se integra en el genoma de la célula produciendo una transfección estable o permanente.

Este enfoque general se puede aplicar a prácticamente todas las células de mamíferos, y un gran número de células se pueden tratar con poco esfuerzo. Pero a muchas líneas celulares no les gusta el precipitado de fosfato de calcio que se adhiere a sus superficies o a su sustrato.

Lipofección:

La entrega de ADN a las células mediante liposomas se denomina lipofección. Los liposomas son pequeñas vesículas preparadas a partir de un lípido adecuado. Inicialmente, se utilizaron lípidos no iónicos para preparar liposomas, de modo que el ADN debía introducirse dentro de las vesículas siguiendo procedimientos específicos de encapsidación.

El uso de lípidos catiónicos para la construcción de liposomas es una clara ventaja ya que el ADN se forma de manera espontánea y eficiente con estos liposomas haciendo que los procedimientos de encapsidación sean innecesarios. Los liposomas catiónicos tienen una única membrana de bicapa lipídica (unilamelar) y se unen a las células de manera eficiente. Probablemente se fusionan con la membrana plasmática y, por lo tanto, envían el ADN (complejado con ellos) a las células, lo que provoca la transfección.

Lipofection es el método de elección para la transfección de células de mamíferos in vitro. También se ha utilizado para administrar ADN en animales vivos mediante inyección directa o inyección intravenosa. Los liposomas catiónicos se han utilizado en inyección intravenosa o intratraqueal en ratones para la expresión de genes marcadores en los pulmones. El suministro dirigido también se ha demostrado mediante la incorporación de proteínas ligando específicas en las membranas de los liposomas.

Infección retroviral:

Los retrovirus recombinantes producen viriones, que se utilizan para infectar células de animales y embriones de ratones. El genoma de ARN del retrovirus recombinante se copia mediante la transcriptasa inversa para producir una copia de ADN (transcripción de ingresos), que se integra en el genoma de la célula. La transcriptasa inversa está codificada por el retrovirus y se produce inmediatamente después de la infección.

Sin embargo, la transcripción inversa solo puede ocurrir en aquellas células que pasan por la fase S, es decir, son mitóticamente activas. La copia de ADN del retrovirus recombinante se integra en el genoma celular en sitios aleatorios, y por lo general no está acompañada de deleciones o reordenamientos.

Microinyección:

En este método, la solución de ADN se inyecta directamente en el núcleo de una célula o en el pronúcleo masculino de un óvulo fertilizado de una a dos células. Típicamente, un conjunto de microinyección consiste en un microscopio de disección estereoscópica de baja potencia (para ver el óvulo y todo el proceso) y dos micromanipuladores, uno para una micropipeta de vidrio para sostener el óvulo por succión parcial y el otro para una aguja de inyección de vidrio para introducir el ADN en el pronúcleo masculino. El pronúcleo masculino es mucho más grande que el pronúcleo femenino de los óvulos de mamíferos fertilizados. Sin embargo, en los huevos de pescado, el ADN se inyecta en el citoplasma del huevo.

El procedimiento general para la microinyección es el siguiente: se induce a las hembras donantes a que se sobre-ovulen utilizando los tratamientos hormonales apropiados. Luego, las hembras superovuladas se aparean con machos fértiles y se recogen quirúrgicamente grandes cantidades de óvulos / embriones de una o dos células fertilizados. Alternativamente, los óvulos no fertilizados se recolectan de hembras super-ovuladas; Los óvulos son fertilizados in vitro. La construcción transgénica se prepara en una solución tampón y se inyecta en los pronosticados masculinos de huevos fertilizados utilizando un conjunto de microinyección.