HLA: Métodos de prueba de histocompatibilidad

Métodos de prueba de histocompatibilidad!

El sistema HLA es ampliamente polimórfico. La naturaleza polimórfica de los alelos HLA fue inicialmente encontrada y definida por métodos serológicos y los antígenos HLA recibieron números. Más tarde se descubrió que los antígenos con la misma especificidad serológica pueden tener diferentes secuencias de aminoácidos. Para 1999, el número de alelos HLA conocidos excedía los 1000, y el número sigue aumentando. Debido al extenso polimorfismo, la nomenclatura de los alelos HLA es compleja y también es difícil para una persona entender la nomenclatura, a menos que la persona esté en el campo de histocompatibilidad.

A los primeros alelos secuenciados se les asignaron nombres con dos dígitos que correspondían a su especificidad serológica. Los primeros dos dígitos están seguidos por otros dos dígitos que indican el orden cronológico de nombramiento por parte del Comité de Nomenclatura de la OMS para Factores del sistema HLA. (Por ejemplo. El primer alelo secuenciado de un gen HLA-A2 se denominó HLA-A 0201, y el segundo alelo secuenciado se llamó HLA-A 0202.)

La tipificación HLA se realiza mediante métodos de tipificación serológica o métodos de tipificación molecular. Los métodos de tipificación serológica de HLA detectan los epítopos de las moléculas de HLA, mientras que los métodos moleculares detectan las secuencias de nucleótidos.

yo. La tipificación HLA que define grupos de alelos (que generalmente se aproximan a las especificidades serológicas) se conoce como tipificación de baja resolución o genérica (por ejemplo, HLA-DRBl-04).

ii. La escritura que resuelve todos los alelos conocidos se conoce como tipificación HLA de alta resolución (por ejemplo, HLA-DR BI x401).

iii. La tipificación que resuelve más allá de las especificidades serológicas pero que no alcanza el nivel de alelo se denomina tipificación de resolución intermedia (por ejemplo, HLA-DRBl-0401/09/13/16/21/26/33).

El Programa Nacional de Donantes de Médula Ósea ha creado un código para facilitar el manejo de estos datos complejos de resolución intermedia. En este sistema, el nombre para HLA-BRBl-0401/09/13/16/21/26/23 / es DRBl-04EJV.

Pruebas de histocompatibilidad por métodos serológicos:

Los linfocitos se utilizan para la tipificación serológica de HLA, la detección de anticuerpos y la comparación cruzada.

Aislamiento de linfocitos para tipificación HLA:

yo. La sangre venosa periférica se mezcla con Ficoll-Hypaque y se centrifuga. La capa que contiene células mononucleares de sangre periférica se aspira, se lava y se usa.

ii. Se utilizan linfocitos aislados de los ganglios linfáticos y el bazo de los cadáveres.

iii. La tipificación HLA para antígenos de clase II se realiza con poblaciones de células B enriquecidas (aproximadamente el 80 por ciento de las células T de sangre periférica normal son células T en reposo que carecen de antígenos de clase II en su superficie).

iv. Se utilizan perlas magnéticas recubiertas de mAbs anti-CD2 o anti-CD3 para aislar células T; y se utilizan perlas magnéticas recubiertas de mAb anti-CD19 para aislar células B

Detección de antígenos HLA de linfocitos:

El ensayo de microtoxicidad es un ensayo de citotoxicidad linfática dependiente del complemento. Las bandejas de tipificación congeladas que contienen pocillos recubiertos con diferentes anticuerpos contra los antígenos HLA están disponibles comercialmente.

Se dispensan aproximadamente 2000 linfocitos en cada pocillo de la bandeja y se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente. (Los anticuerpos en cada pocillo se unen a antígenos HLA específicos en la superficie de los linfocitos, si están presentes).

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Se añaden cinco µl de complemento (generalmente, suero de conejo) a cada pocillo y se incuban durante 60 minutos, (las proteínas del complemento causan la muerte de los linfocitos que están recubiertos con mAb. En ausencia de la unión de mAb con los linfocitos, el complemento no se activa y los linfocitos no son asesinados).

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Se agrega el tinte eosina Y, seguido de formaldehído (formaldehído que corrige la reacción).

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Luego, las células muertas y las células vivas en cada pozo se cuentan bajo un microscopio de contraste de fase.

yo. Las células inflamadas y oscuras son células muertas (el colorante eosina Y entra en las células muertas).

ii. Las células brillantes y refráctiles son células vivas (el colorante eosina Y no entra en las células vivas).

Cada pocillo de la bandeja se visualiza individualmente para detectar células muertas y células vivas. El porcentaje de células muertas en cada pozo se calcula y el puntaje se realiza según la Tabla 27.5.

Tabla 27.5: Puntuación de la prueba de citotoxicidad linfática para HLA:

El tipo de HLA de un individuo se determina mediante la interpretación de la reacción de los linfocitos del individuo con diferentes antisueros utilizados en la prueba de citotoxicidad linfática dependiente del complemento.

yo. Se espera que cada individuo tenga dos antígenos HLA-A, dos HLA-B y dos HLA-C en la superficie de los linfocitos.

ii. Si un individuo muestra solo un antígeno HLA-A o HLA-B o HLA-C en la prueba, probablemente esa persona sea homocigótica para ese antígeno particular o el panel de antisueros utilizado en la prueba no tenga el anticuerpo específico contra el segundo antígeno o hay baja expresión de moléculas de HLA en la superficie de los linfocitos.

El ensayo de citotoxicidad linfática dependiente del complemento para los antígenos HLA-DR y HLA-DQ se realiza mediante el uso de células B aisladas por perlas magnéticas recubiertas con mAB o células B aisladas sobre lana de nailon.

La mayoría de los sueros de tipificación HLA se obtienen de mujeres multíparas. Dado que las mujeres mutíparas están expuestas repetidamente a los antígenos HLA de los fetos, los sueros de las mujeres multíparas tienen anticuerpos contra los antígenos HLA. Se utilizan casi 200 antisueros diferentes para escribir los antígenos HLA de un individuo.

Inicialmente se pensó que se podrían desarrollar mAb para cada uno de los antígenos HLA y que la tipificación de HLA sería simple. Pero muchos mAbs se unen a los epítopos comunes en lugar de a los epítopes privados de los antígenos HLA. Además, muchos mAb murinos no arreglan el complemento (y, por lo tanto, su uso en los ensayos de citotoxicidad linfática dependiente del complemento es limitado).

Sin embargo, los mAb murinos se pueden usar en el método ELISA y en el método de citometría de flujo, que no requieren complemento. En los últimos tiempos, muchos laboratorios prefieren utilizar la tipificación HLA molecular, en lugar de la tipificación HLA serológica.

Detección del suero del receptor del trasplante para anticuerpos contra los antígenos l-ILA (detección de anticuerpos):

La presencia de anticuerpos contra los antígenos HLA en el suero de un receptor de trasplante de órgano en espera generalmente se realiza mediante citotoxicidad linfática dependiente del complemento. Los linfocitos con antígenos HLA conocidos y complemento se mezclan con el suero del receptor. Después de la incubación apropiada, se cuentan los linfocitos muertos y los linfocitos vivos. Luego se calcula el porcentaje de anticuerpos reactivos del panel (PRA).

PRA = Número de células positivas / Número de células del panel total x 100

PRA indica el grado de sensibilización del receptor en espera a los antígenos HLA.

Método ELISA para detectar anticuerpos de HLA en suero:

El método ELISA es fácil, rápido y no requiere linfocitos vivos, sino también complemento. Los antígenos HLA purificados por afinidad están recubiertos en las paredes de la placa de microtitulación

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Se agrega el suero del receptor y se incuba.

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Después del lavado, se añade IgG antihumana conjugada con enzimas y se incuba.

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Después del lavado, se añade el sustrato y se incuba.

yo. El desarrollo del color en un pozo particular indica la presencia de anticuerpos IgG contra el antígeno HLA recubierto en ese pozo particular.

ii. La falta de desarrollo del color en un pozo particular indica la ausencia de anticuerpos contra el antígeno HLA particular recubierto en ese pozo.

Citómetro de flujo para detectar anticuerpos de HLA en suero:

Las micro perlas recubiertas con antígenos HLA se incuban con el suero del paciente y luego con anticuerpos IgG antihumanos marcados con fluorescencia. El porcentaje de perlas que se tiñen sobre el fondo proporciona la medida del porcentaje de anticuerpos reactivos del panel (ARP).

Pruebas cruzadas:

Si la sangre de un receptor en espera contiene anticuerpos contra los antígenos HLA del donante, los antígenos HLA en las células del donante serán atacados por los anticuerpos del receptor, después del trasplante. Por lo tanto, antes del trasplante, es esencial saber si el receptor tiene anticuerpos contra los antígenos HLA del donante.

Si los anticuerpos específicos del antígeno HLA del donante están presentes en el suero del receptor, el trasplante será rechazado. Se realiza una comparación cruzada para detectar la presencia de anticuerpos séricos del receptor en espera contra los antígenos HLA de donante propuestos.

La citotoxicidad linfática coincide con los linfocitos de la sangre periférica:

Los linfocitos de sangre periférica del donante propuesto (que contiene aproximadamente 80 por ciento de células T (que portan antígenos de clase I del MHC) y 20 por ciento de células B y monocitos (que llevan antígenos de clase I y clase II del MHC) se mezclan con el suero del receptor que espera y se incuban .

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Se añade complemento y se incuba.

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El tinte eosina Y se agrega y se incuba.

yo. Se cuenta el número de células muertas y viables y se calcula el porcentaje de células muertas. 50 por ciento o más de muerte celular indica una fuerte coincidencia positiva positiva (es decir, el suero del receptor tiene anticuerpos capaces de reaccionar con los antígenos HLA del donante). Una fuerte coincidencia positiva entre un receptor y un donante propuesto es una contraindicación para el trasplante de órganos del donante al receptor.

Para determinar si los anticuerpos del receptor se dirigen contra los antígenos de clase I o clase II, se realiza el emparejamiento cruzado de citotoxicidad de las células T (utilizando células T enriquecidas) o el emparejamiento cruzado de citotoxicidad de las células B (utilizando células B enriquecidas), respectivamente.

La comparación cruzada del citómetro de flujo es 30-250 veces más sensible que los métodos serológicos visuales para la detección de anticuerpos IgG contra antígenos HLA en la superficie de los linfocitos.

Los linfocitos de la sangre periférica del donante propuesto se incuban con mAbs anti-CD3 marcados (por ejemplo, un tinte fluorescente que emite luz verde), que se unen a las células T.

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Las células T unidas a ani-CD3 marcadas se separan de las células B en el citómetro de flujo.

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Las células T teñidas y separadas ahora se incuban con el suero del receptor en espera.

yo. Los anticuerpos séricos del receptor contra los antígenos HLA de células T del donante, si están presentes, se unirán a las células T.

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Después del lavado, se agrega y se incuba un IgG antihumano marcado con un flurocromo (que emite un color que no sea verde, por ejemplo el color rojo).

ii. La IgG antihumana marcada con florocromo se unirá a los anticuerpos HLA del receptor, que se unen a las células T del donante.

El citómetro de flujo cuenta el número de células T (color rojo y verde) y las células T (color verde) y crea un histograma.

Correspondencia cruzada para autoanticuerpos contra linfocitos:

Durante una coincidencia cruzada, los autoanticuerpos contra los linfocitos en el suero del receptor pueden unirse no específicamente a los linfocitos del donante y dar un resultado de coincidencia cruzada falso positivo; y, en consecuencia, el donante está erróneamente descalificado para donar un órgano al receptor en particular. Los autoanticuerpos también pueden enmascarar la presencia de anticuerpos específicos contra el donante.

La presencia de autoanticuerpos frente a los linfocitos se detecta mediante la autocomprobación, en la que los propios linfocitos y el suero del receptor se combinan en una prueba de citotoxicidad estándar. Las coincidencias cruzadas de autoanticuerpos se realizan de manera rutinaria junto con todas las coincidencias cruzadas de donantes vivos para cada suero que se analiza.

Métodos de biología molecular para tipificación HLA:

La mayoría de los métodos de tipificación molecular utilizan la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar selectivamente los segmentos del gen HLA necesarios para la tipificación.

Mecanografía de cebado específico de secuencia (SSP):

El ADN del individuo se extrae de las células o tejidos.

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El ADN se agrega a los tubos que contienen diferentes conjuntos de cebadores para diferentes genes HLA. Se incluye un conjunto adicional de cebadores como control positivo de amplificación en todos los tubos.

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Se agregan los otros componentes de la reacción de PCR (como los nucleótidos de ADN, la ADN polimerasa, el tampón) y se realiza el ciclo térmico.

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Los productos amplificados se someten a electroforesis en gel con bromuro de etidio y se fotografían bajo luz UV.

yo. La presencia de banda indica que la muestra de ADN tiene la secuencia correspondiente al tipo de HLA particular.

ii. La ausencia de banda indica que la muestra de ADN no contiene la secuencia particular del tipo HLA.

iii. La banda de control de amplificación interna debe estar presente para la interpretación.

Los conjuntos de cebadores para la tipificación HLA están disponibles comercialmente.

yo. Para HLA-A, B y C, se requieren aproximadamente 100-200 reacciones.

ii. Para HLA-DRB, se requieren aproximadamente 20-30 reacciones.

Hibridación de la sonda de oligonucleótidos específica de secuencia (SSOP):

El método SSOP implica la amplificación selectiva del objetivo HLA seguido de hibridación con un panel de sondas oligonucleotídicas. Hay dos formatos SSOP.

yo. Mancha de punto o ranura:

El ADN amplificado está unido al soporte sólido (como la membrana de nylon) y la sonda de hibridación está en solución.

ii. Punto inverso o mancha de ranura:

La sonda se une al soporte sólido y se hibrida con el ADN amplificado en solución.