Replicación del ADN: Notas sobre la replicación, reparación y recombinación del ADN

Notas sobre la replicación del ADN, la reparación y la recombinación!

Replicación del ADN:

Replicación del ADN semiconservador:

La replicación del ADN es una función autocatalítica del ADN. Generalmente ocurre durante la fase S del ciclo celular cuando los cromosomas se encuentran en una forma altamente extendida. Según lo propuesto por Watson y Crick, la replicación del ADN es semi-conservadora.

En la replicación semiconservadora, las dos cadenas se separarían entre sí, mantendrían su integridad y cada una sintetizará, a partir del conjunto de nucleótidos, su cadena complementaria. El resultado sería que la molécula recién sintetizada transportaría o conservaría una de las dos cadenas de la molécula parental y la otra cadena se ensamblaría nuevamente. Hay pruebas suficientes para demostrar que el ADN bicatenario realmente se replica mediante un método semiconservador.

Experimento de Meselson y Stahl (1958):

Estos trabajadores cultivaron Escherichia coli en un medio que contenía ¹⁵ isótopos N. Después de que estos se habían replicado durante algunas generaciones en ese medio, ambas hebras de este ADN contenían ¹⁵ N como constituyentes de purinas y pirimidinas. Cuando estas bacterias con ¹⁵ N se transfirieron a un medio de cultivo que contenía ¹⁴ N, se encontró que el ADN separado de una nueva generación de bacterias posee una hebra más pesada que la otra.

La cadena más pesada representa la cadena parental y la más ligera es la nueva sintetizada a partir del medio de cultivo, lo que indica un método semiconservador de replicación de ADN y excluye los modelos conservativos y dispersivos de la síntesis y replicación de ADN.

La replicación conservadora no produciría ninguna molécula de ADN con una constitución "híbrida". Si la replicación fuera dispersiva, habría habido un cambio del ADN de "pesado a" ligero "a través de cada generación.

Los estudios posteriores han verificado la conclusión de Meselson y Stahl de que la replicación del ADN es semiconservadora y la ha extendido a muchos otros organismos, incluidas las plantas y animales superiores.

El experimento de autorradiografía de Cairn:

Utilizó timina radiactiva o timidina tritiada. Al cultivar E. coli en un medio de cultivo que contiene timidina tritiada, la radioactividad se incorporó en las moléculas hijas del ADN.

En la autorradiografía, la molécula de ADN duplicada muestra una horquilla de replicación, el punto en el que dos cadenas se convierten en cuatro. Después de la primera replicación, la radioactividad se ve incorporada en solo una de las cadenas de ADN y se encuentra que ambas cadenas están marcadas después de la segunda replicación. Esto apoya los modos semiconservadores de replicación del ADN.

Los experimentos de JH Taylor en las puntas de las raíces de Viciafaba (1957) también confirman el método semiconservador de la replicación del ADN.

yo. Replicación de ADN discontinua:

Okazaki sugirió que la síntesis de ADN procede simultáneamente en ambas cadenas de ADN utilizando la misma enzima ADN polimerasa en forma de pequeños fragmentos aislados. Estos segmentos se conocen como piezas de Okazaki y consisten en 1000-2000 nucleótidos. Estos se unen entre sí por la enzima polinucleótido ligasa, completando la formación de la cadena de polinucleótido.

La síntesis discontinua de ADN está respaldada por un experimento auto-radiográfico.

ii. Replicación unidireccional y bidireccional de ADN:

J. Cairns de sus experimentos concluyó que la síntesis de ADN comienza en un punto fijo en los cromosomas y avanza en una dirección, pero experimentos recientes sugieren una replicación bidireccional.

Levinthal y Cairns propusieron que durante la replicación, las dos cadenas no se separen completamente antes de la replicación. En su lugar, comienzan a descomprimir en un extremo y, simultáneamente, los segmentos descomprimidos comienzan a atraer sus pares de nucleótidos. De esta manera, la descompresión de las cadenas de ADN originales y la síntesis de las cadenas de ADN nuevas van de la mano.

ADN polimerasa:

La ADN polimerasa es la principal enzima de la replicación del ADN. Su actividad fue demostrada por primera vez por Kornberg en 1956. Cataliza la adición covalente de desoxirribonucleótidos al 3'-OH de un nucleótido preexistente llamado cebador.

La enzima ADN polimerasa-1 ahora se considera una enzima reparadora del ADN en lugar de una enzima de replicación. Se sabe que esta enzima tiene cinco sitios activos, a saber, sitio de plantilla, sitio de cebador, sitio de exonucleasa o escisión 5 '-> 3', sitio de trifosfato de nucleósido y sitio de escisión 3 '-> 5' (o sitio de exonucleasa 3 '-> 5' ).

ADN polimerasa I:

Está involucrado principalmente en la eliminación de cebadores de ARN de Okazaki o fragmentos precursores y en el llenado de los huecos resultantes debido a su capacidad de polimerización de 5 '-> 3'. La enzima ADN polimerasa I también puede eliminar los dímeros de timina producidos debido a la radiación UV y llenar el vacío debido a la escisión. Esto se denomina función de lectura o edición de esta enzima.

ADN polimerasa-II:

Esta enzima se parece a la ADN polimerasa-I en su actividad, pero es una enzima reparadora del ADN y provoca el crecimiento en la dirección 5 '-> 3', utilizando grupos 3'-OH libres.

ADN polimerasa-III:

Juega un papel esencial en la replicación del ADN. Es una enzima multimérica o holoenzima que tiene diez subunidades tales como α, β, ε, θ, г, y, δ, δ ', x y Ψ. Todas estas diez subunidades son necesarias para la replicación del ADN in vitro; Sin embargo, todos tienen diferentes funciones. Por ejemplo, la subunidad α tiene una actividad de corrección o edición de 3 '-> 5' exonucleasa. La enzima central comprende tres subunidades: α, β y θ. Las siete subunidades restantes aumentan la procesividad (procesividad significa rapidez y eficiencia con la que una ADN polimerasa extiende la cadena de crecimiento).

ADN polimerasa eucariótica:

Se encuentra que los yotes de Eukai (p. Ej., Levadura, hígado de rata, células tumorales humanas) contienen los siguientes cinco tipos de ADN polimerasas:

(i) ADN polimerasa α:

Esta enzima de peso molecular relativamente alto también se llama polimerasa citoplásmica o polimerasa grande. Se encuentra tanto en el núcleo como en el citoplasma.

(ii) ADN polimerasa β:

Esta enzima también se llama polimerasa nuclear o polimerasa pequeña y se encuentra solo en vertebrados.

(iii) ADN polimerasa y:

Esta enzima se llama polimerasa mitocondrial y está codificada en el núcleo.

(iv) ADN polimerasa δ:

Esta enzima se encuentra en células de mamíferos y es dependiente de PCNA para la procesividad de la síntesis de ADN (PCNA = antígeno nuclear de células en proliferación).

(v) ADN polimerasa ε:

Anteriormente se conocía como ADN polimerasa 5II. Esta enzima es independiente de PCNA y se produce en células HeLa de mamíferos y en levaduras en ciernes.

La gran ADN polimerasa a es la enzima ADN polimerasa predominante en las células eucarióticas y durante mucho tiempo se creyó que era la única enzima involucrada en la replicación del ADN. Pero ahora, una polimerasa más, a saber, la ADN polimerasa 8 también se encuentra involucrada en la replicación del ADN eucariótico.

Cebadores de ADN:

Estas enzimas catalizan la síntesis de cebadores de ARN, que son un requisito previo para el inicio de la replicación del ADN en la gran mayoría de los organismos. Antes de que comience la replicación del ADN, los segmentos cortos de oligonucleótidos de ARN, llamados cebadores de ARN o simplemente los cebadores, deben ser sintetizados por la enzima ADN primasa utilizando trifosfatos de ribonucleósido.

Este cebador de ARN se sintetiza copiando una secuencia de bases particular de una cadena de ADN y se diferencia de una molécula de ARN típica en que, después de la síntesis, el cebador permanece unido por hidrógeno a la plantilla de ADN.

Los cebadores tienen una longitud de aproximadamente 10 nucleótidos en los eucariotas y se elaboran a intervalos en la hebra rezagada, donde son alargados por la enzima ADN polimerasa para comenzar cada fragmento de okazaki. Estos cebadores de ARN luego se extirpan y se rellenan con ADN con la ayuda del sistema de reparación de ADN en eucariotas.

En las bacterias, se sabe que dos enzimas diferentes sintetizan oligonucleótidos de ARN de cebador: la ARN polimerasa (en la cadena principal) y la ADN primasa (en la cadena retrasada).

Polinucleótido Ligasa:

Esta enzima es una enzima importante tanto en la replicación del ADN como en la reparación del ADN. La ADN ligasa cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre el grupo 5'-fosforilo de un nucleótido y el grupo 3-OH del vecino inmediato en el lado de una muesca en una cadena de ADN; Así sella las muescas en una hebra de ADN.

Endonucleasas:

Las endonucleasas, particularmente las endonucleasas de restricción, también son importantes durante la replicación del ADN, así como la reparación del ADN. Durante la replicación del ADN, una endouncleasa puede producir un nick en el origen para iniciar la replicación o puede inducir que las mellas generen un giro para facilitar el desenrollamiento del ADN.

Enzimas involucradas en la apertura de la hélice de ADN:

Helicasas de ADN:

Las helicasas de ADN son enzimas de desenrollado dependientes de ATP que promueven la separación de las dos cadenas parentales y establecen horquillas de replicación que se alejarán progresivamente del origen. El desenrollamiento de la plantilla hélice de ADN en una horquilla de replicación podría, en principio, ser catalizado por dos helicasas de ADN, actuando en concierto, una a lo largo de la hebra principal y la otra a lo largo de la hebra retrasada.

Cadena desestabilizadora de hélices (también llamadas proteínas de unión a ADN de cadena simple o SSBPs):

Detrás de la horquilla de replicación, se evita que las hebras de ADN individuales se rebobinen unas sobre otras (o formen bucles de horquilla de doble hebra en cada hebra) por la acción de las proteínas SSB. Las proteínas SSB se unen a las cadenas de ADN expuestas sin cubrir las bases, que, por lo tanto, permanecen disponibles para el proceso de plantillas.

Topoisomerasas (gyrases ADN):

La acción de una helicasa introduce un supercoil positivo en el ADN dúplex delante de la horquilla de replicación. Las enzimas, llamadas topoisomerasas, relajan el supercoil uniéndolo al dúplex supercoil transitorio, cortando una de las hebras y girándola a través de la hebra ininterrumpida. La mecha se vuelve a sellar.

Un tipo de topoisomerasa (es decir, topoisomerasa I) provoca una ruptura de una sola hebra o muesca que permite que las dos secciones de la hélice de ADN a cada lado de la mella giren libremente entre sí, utilizando el enlace fosfodiéster en la hebra opuesta a la mella como Un punto de giro. Un segundo tipo de topoisomerasa (es decir, topoisomerasa II) forma un enlace covalente a ambas cadenas de hélice de ADN al mismo tiempo, lo que hace que se rompa la hebra doble transitoria en la hélice.

Replicón:

Un replicón es la unidad de ADN en la que tienen lugar los actos individuales de replicación, es decir, es capaz de replicación de ADN independiente de otros segmentos de ADN. Por lo tanto, cada replicón tiene un origen en el que se inicia la replicación y puede tener un término en el que se detiene la replicación.

Los cromosomas bacterianos y virales generalmente contienen un solo replicón / cromosoma. Aunque el fago T, tiene dos orígenes, uno primario y otro secundario, pero en presencia del origen primario, el origen secundario es, por regla general, no funcional. En E. coli, el punto de origen se identifica como orus genético local.

Un origen procariótico completo admite las siguientes tres funciones: (1) inicio de la replicación, (2) control de la frecuencia de los eventos de iniciación y (3) la segregación de los cromosomas replicados en las células hijas.

Se han identificado orígenes en bacterias, levaduras, cloroplastos y mitocondrias; su característica general importante es que son ricos en A: T, lo que puede ser importante para facilitar el desenrollado durante la replicación. El origen bacteriano contiene muchos sitios cortos diferentes (<10 pb) que son necesarios para su función; estos sitios a veces están separados por distancias específicas pero no por secuencias específicas. Estos sitios específicamente ubicados son necesarios para la unión de diferentes proteínas involucradas en la replicación del ADN.

Varios replicones procarióticos tienen sitios específicos, llamados terminus, que detienen el movimiento de la horquilla de replicación y, por lo tanto, terminan la replicación del ADN. El cromosoma de E. coli tiene dos extremos, llamados T ₁ y T ₂ ubicados a aproximadamente 100 Kb a cada lado del punto donde se encontrarían las réplicas de las horquillas. Cada término es específico para una dirección de movimiento de la horquilla.

El T ₁ y el T ₂ están dispuestos de tal manera que cada bifurcación debe tener que pasar la otra para alcanzar el término específico para él. La terminación de la replicación requiere el producto del gen tus, que probablemente codifica una proteína que reconoce T y T ₂ .

En los eucariotas, cada cromosoma tiene varios replicones (p. Ej., Levadura, 500; Drosophila, 3, 500; ratón 25, 000; Viciafaba, 35, 000). En cualquier momento dado durante la fase S, solo algunos de estos replicones se replican; Cada replicón parece estar activado en un momento específico en una secuencia específica. La longitud de un replicón eucariótico puede variar desde 40 Kb en levadura y Drosophila hasta aproximadamente 300 Kb en Vicia.

El número de replicones detectables parece variar con la etapa de desarrollo y el tipo de célula o tejido. Esto se explica sobre la base de los orígenes específicos del tejido, de modo que algunos orígenes están activos en algunos tejidos, mientras que otros están activos en otros tejidos.

Esto se ejemplifica en Drosophila, donde las células embrionarias tempranas tienen 10 veces más replicones que las células somáticas adultas. La evidencia disponible sugiere que los replicones eucariotas no tienen terminios.

Fidelidad de la replicación:

La tasa de error de la replicación del ADN es mucho más baja que la de la transcripción debido a la necesidad de preservar el significado del mensaje genético de una generación a otra. Por ejemplo, la tasa de mutación espontánea en E. coli es aproximadamente un error por cada 10 ¹⁰ bases incorporadas durante la replicación.

Esto se debe principalmente a la presencia de las formas tautoméricas menores de las bases que tienen propiedades de apareamiento de bases alteradas. La tasa de error se minimiza por una variedad de mecanismos. Las ADN polimerasas solo incorporarán un nucleótido entrante si forma el par de bases correcto con el nucleótido de plantilla en su sitio activo.

El error ocasional es detectado por la exonucleasa de corrección de lectura 3 '-> 5' asociada con la polimerasa. Esto elimina el nucleótido incorrecto del extremo 3 'antes de cualquier incorporación adicional, permitiendo que la polimerasa inserte la base correcta. Para que la prueba de corrección exonuclease funcione correctamente, debe ser capaz de distinguir un par de bases correcto de uno incorrecto.

El aumento de la movilidad de los pares de bases "sin anclar" en el extremo 5 'de los nuevos fragmentos de hebra de ADN retrasados ​​iniciados significa que nunca pueden parecer correctos y, por lo tanto, no se pueden corregir. Por lo tanto, los primeros pocos nucleótidos son ribonucleótidos (ARN), por lo que posteriormente pueden identificarse como material de baja fidelidad y reemplazarse con ADN alargado (y corregido) del fragmento adyacente. Los errores que escapan a la corrección se corrigen mediante un mecanismo de reparación de desajuste.

Mecanismo de replicación del ADN en procariotas:

La replicación in vitro del ADN ha sido ampliamente estudiada en E. coli y en los fagos y plásmidos de E. coli. En E. coli, el proceso de replicación del ADN implica los siguientes tres pasos principales:

1. Iniciación de la replicación del ADN:

Este proceso comprende tres pasos: (i) reconocimiento del origen (O), (ii) apertura del dúplex de ADN para generar una región de ADN monocatenario y (iii) captura de la proteína Dna B (es decir, 5 '3' helicasa ; también actúa como el activador de primasa). Por lo tanto, el complejo ATP Dna-A (o proteína iniciadora) se une a las regiones de repetición invertida (R, R, _{RvR 4} ) de 9 pb de ori C de E. coli y promueve la apertura del dúplex de ADN en una región de tres Repeticiones directas de secuencia de 13 pb (llamadas 13 mers).

La apertura se produce desde la derecha 13-mer hacia la izquierda y requiere ADN superenrollado negativamente y proteínas iniciadoras HU o IHF. El ADN B (-helicase) se transfiere al ADN monocatenario expuesto y provoca el desenrollamiento del ADN en presencia de A TP, proteína SSB y girasa de ADN (una topoisomerasa).

Esto da como resultado el desenrollado del dúplex de ADN y la replicación de ori C se realiza en ambas direcciones (bidireccional); La unión de SSB se produce en regiones de una sola hebra y dos complejos de Dna B (= primosomas) se cargan uno en cada hebra.

2. Alargamiento de la cadena de ADN:

Este paso requiere la presencia de las siguientes enzimas y factores: 1. Dna B o helicasa (también llamada promotor móvil); 2. primasa (Dna G); 3. ADN polimerasa holoenzima (o ADN pol III HE); 4. proteína SSB; 5. ARNasa H que elimina los cebadores de ARN; 6. ADN polimerasa I que se usa para llenar el espacio creado debido a los cebadores de ARN y 7. ADN ligasa (que convierte los fragmentos de okazaki sin cebador en una cadena continua). Durante la iniciación a la transición de elongación, ocurren los siguientes eventos:

(i) Cuando la helicasa (o Dna B) viaja en la dirección 5 '-> 3', genera una horquilla de replicación al abrir el dúplex de ADN.

(ii) La hebra de ADN que tiene helicasa se convierte en la hebra retrasada. La ADN primasa se asocia con la helicasa Dna B, formando el primosoma que sintetiza múltiples cebadores para la cadena retardada y un cebador de ARN único para la cadena principal.

(iii) Para la síntesis de la hebra retrasada, el ADN pol III HE debe trabajar en la misma hebra a la que se une la helicasa Dna B, pero viaja en dirección opuesta.

(iii) DnaB helicase, Dna Gprimase y DNA pol III FIE trabajan juntas en la elongación de la hebra. El ensamblaje de helicasa y ADN polimerasa sigue siendo procesivo, es decir, permanecen estrechamente unidos a la horquilla y permanecen unidos a lo largo de la reacción.

La síntesis (- alargamiento) de las cadenas retrasadas y adelantadas tiene lugar mediante métodos algo diferentes; es mucho más complejo para la cadena retrasada que para la cadena principal:

(A) Síntesis discontinua en la hebra retrasada:

1. La primasa se toma de la solución y se activa mediante helicasa (DnaB) para sintetizar un cebador de ARNa (de 10 a 20 nt o nucleótidos de longitud) en la cadena rezagada.

2. Los cebadores de ARN son reconocidos por el ADN pol III HE en la hebra retrasada y se utilizan para la síntesis de fragmentos precursores u okazaki. De hecho, cada nuevo cebador de ARN es reconocido por la subunidad gamma (y) del ADN pol III HE y cargado con la subunidad p de la misma polimerasa. Esta subunidad p precargada puede luego capturar el núcleo del ADN poli III HE cuando esté disponible después de finalizar su trabajo sintético en el fragmento de okazaki anterior.

3. Al completar los fragmentos de okazaki, los cebadores de ARN se cortan con la ADN polimerasa 1, que luego llena los huecos resultantes con el ADN.

4. Después de que la ADN polimerasa I agregue los desoxirribonucleótidos finales en el espacio dejado por el cebador extirpado, la enzima ADN ligasa forma el enlace fosfodiéster que une el extremo libre 3 'del reemplazo del cebador al extremo 5' del fragmento okazaki.

(B) Síntesis continua en la cadena principal:

1. En la replicación de ADN bidireccional, la cadena principal se ceba una vez en cada una de las cadenas parentales.

2. El cebador de ARN de la cadena principal se sintetiza por la enzima ARN polimerasa.

3. DNA pol III HE causa el alargamiento de la cadena principal y, finalmente, las enzimas DNA pol 1 y ligasa dan el toque final a la cadena principal como en el caso de la cadena retrasada.

Replicación del ADN en eucariotas :

La replicación de ADN eucariótico requiere dos enzimas ADN polimerasa diferentes, a saber, ADN polimerasa a y ADN polimerasa δ. La ADN polimerasa δ sintetiza el ADN en la cadena principal (síntesis continua de ADN), mientras que la ADN polimerasa a sintetiza el ADN en la cadena retrasada (síntesis discontinua de ADN). Además de estas dos enzimas, la replicación del ADN: (1) antígeno T; (2) factor de replicación A o RF-A (también llamado RP-A o SSB eucariótico); (3) topoisomerasa I; (4) topoisomerasa II; (5) proliferación - antígeno nuclear celular (PCNA, también llamado ciclina), y (6) factor de replicación Cor RF-C.

El proceso de replicación de ADN eucariótico implica los siguientes pasos:

1. Antes del inicio de la síntesis de ADN, hay una etapa presintética de 8-10 minutos de duración para la formación del complejo de ADN desenrollado. Este paso solo necesita tres proteínas purificadas, a saber, antígeno T (T-ag o antígeno tumoral), RF-A y topiosomerasas I y II.

2. El antígeno T, que utiliza su dominio de unión al ADN, forma un complejo de múltiples subunidades con el sitio I y el sitio II en presencia de A TP y causó el desenrollamiento local.

3. Se produce un desenrollado dúplex más extenso debido a la asociación de RF-A y una topoisomerasa con la ayuda del componente de helicasa de ADN de T-ago. Las topoisomerasas ayudan a desenrollar el ADN mediante la alteración de la topología del ADN en la horquilla de replicación.

4. Las proteínas RF-A o SSB se unen a ADN monocatenario desenrollado.

5. La síntesis del primer ARN se realiza mediante primasa que está estrechamente asociada con la ADN polimerasa ej.

6. La ADN polimerasa a ayuda en la síntesis de un fragmento de okazaki en la dirección 5 'a 3'.

7. El factor de replicación C (o RF-C) y PCNA (ciclina) ayudan a cambiar las ADN polimerasas, de modo que la pol a se reemplaza por pol 5, que luego sintetiza continuamente el ADN en la cadena principal.

8. Luego se sintetiza otro fragmento de okazaki a partir de la bifurcación de replicación en la hebra retrasada por el complejo pol a - primasa y este paso se repite una y otra vez, hasta que se cubre toda la molécula de ADN.

9. Los cebadores de ARN se eliminan y los huecos se llenan como en la replicación del ADN procariótico.

Recientemente, se ha enfatizado el papel de la ADN polimerasa e en la replicación del ADN, por lo que ahora se sabe que tres ADN polimerasas (a, δ y ε) están involucradas en la replicación del ADN eucariótico. A. Sugino y colaboradores han propuesto que la ADN polimerasa a podría funcionar tanto en la cadena anterior como en la retrasada (ya que la polimerasa a tiene actividad α primasa), mientras que la polimerasa e y la polimerasa 5 están involucradas en el alargamiento de las cadenas anterior y posterior respectivamente.

Daño del ADN y mecanismo de reparación

Tipos de daños en el ADN:

1. Lesiones de ADN:

Una alteración en la estructura química o física normal del ADN se denomina lesiones del ADN. Muchos agentes exógenos, como los productos químicos y la radiación, pueden causar cambios en las posiciones de los átomos de nitrógeno y carbono en los sistemas de anillos heterocíclicos de las bases y algunos de los grupos funcionales exocíclicos (es decir, los grupos ceto y amino de las bases).

Esto puede llevar a la pérdida del emparejamiento de bases o al emparejamiento de bases alterado (por ejemplo, un A alterado puede emparejarse con C en lugar de T). Si se permite que dicha lesión permanezca en el ADN, una mutación puede fijarse en el ADN mediante mutagénesis directa o indirecta.

Alternativamente, el cambio químico puede producir una distorsión física en el ADN que bloquea la replicación y / o la transcripción, causando la muerte celular. Por lo tanto, las lesiones de ADN pueden ser mutagénicas y / o letales. Algunas lesiones son espontáneas y se producen debido a la reactividad química inherente del ADN y la presencia de especies químicas normales y reactivas dentro de la célula.

Por ejemplo, la citosina base se somete a una desaminación hidrolítica espontánea para dar uracilo. Si no se repara, el uracilo resultante formaría un par de bases con adenina durante la replicación posterior, dando lugar a una mutación puntual. La depuración es otra reacción hidrolítica espontánea que implica la escisión del enlace N-glicosílico entre el N-9 de las bases A y G y C-1 de la purina del azúcar de desoxirribosa y, por lo tanto, la pérdida de las bases de purina del ADN. La columna vertebral de azúcar-fosfato del ADN permanece intacta. El sitio apurínico resultante es una lesión no codificante, ya que la información codificada en las bases de purina se pierde.

2. Daño oxidativo:

Esto ocurre en condiciones normales debido a la presencia de especies reactivas de oxígeno (ROS) en todas las células aeróbicas, por ejemplo, superóxido, peróxido de hidrógeno y, lo que es más importante, el radical hidroxilo (OH). Este radical puede atacar el ADN, I en varios puntos, produciendo una gama de productos de oxidación con propiedades II alteradas, por ejemplo, 8-oxoguanina, 2-oxoadenina y 5-formiluracilo. Los niveles de estos pueden aumentarse con radicales hidroxilo de la radiolisis del agua causada por la radiación ionizante.

3. Alquilación:

Los agentes alquilantes son sustancias químicas electrofílicas que agregan fácilmente grupos alquilo (p. Ej., Metilo) a varias posiciones en ácidos nucleicos distintos de los metilados por las enzimas de metilación normales. Algunos ejemplos comunes son el sulfonato de metilmetano (MMS) y la etilnitrosourea (ENU).

Ejemplos típicos de bases metiladas son 7-metilguanina, 3-metil-adenina, 3-metilguanina y 0 ⁶ -metilguanina. Algunas de estas lesiones son potencialmente letales, ya que pueden interferir con el desenrollamiento del ADN durante la replicación y la transcripción. La mayoría también son indirectamente mutagénicos; sin embargo, 0 ⁶ -metilguanina es una lesión directamente mutagénica, ya que puede emparejarse con timina durante la replicación.

4. Aductos voluminosos:

Los dímeros de ciclobutano pirimidina están formados por la luz ultravioleta de pirimidinas adyacentes en una hebra por ciclación de los átomos de carbono C5 y C6 de doble enlace de cada base para dar un anillo de ciclobutano. La pérdida resultante del emparejamiento de bases con la cadena opuesta causa una desnaturalización localizada del ADN que produce una lesión voluminosa que interrumpiría la replicación y la transcripción. Otro tipo de dímero de pirimidina, el fotoproducto 6, 4, resulta de la formación de un enlace entre C6 de una base de pirimidina y C4 de la base adyacente.

Cuando el carcinógeno de alquitrán de hulla benzo [a] pireno se metaboliza por el citocromo P-450 en el hígado, uno de sus metabolitos (un epóxido de diol) puede unirse covalentemente al grupo 2-amino de los residuos de guanina. Muchos otros agentes de arilación aromáticos forman aductos covalentes con el ADN. El carcinógeno hepático aflatoxina B, también se une covalentemente al ADN.

Reparación del ADN:

Los sistemas de reparación reconocen una variedad de cambios en el ADN para iniciar la acción. Una célula puede tener varios sistemas para lidiar con el daño del ADN. Estos sistemas incluyen lo siguiente: (1) Reparación directa, (2) Reparación por escisión (3) Reparación no coincidente, (4) Sistemas tolerantes y (5) Sistemas de recuperación.

1. Reparación directa:

La reversión o simple eliminación del daño al ADN se conoce como reparación directa, por ejemplo, la eliminación de los enlaces covalentes entre los dos 4 y dos 5 carbonos de los dos residuos de timina que participan en la formación de dímeros de timina.

Los dímeros de timina generalmente se forman debido a la radiación UV e interfieren con la replicación y la transcripción. Kelner (1949) observó que una gran cantidad de bacterias podían sobrevivir a grandes dosis de radiación UV; Si estuvieran expuestos a una fuente intensa de luz visible.

Este fenómeno se llama fotorreactivación. Más tarde se demostró que durante la irradiación UV una enzima particular se une selectivamente al ADN bacteriano. Durante el proceso de fotorreactivación, la enzima es activada por la luz visible. Rompe los dímeros de timina, restaurándolos así a su forma original. Este proceso de reparación está mediado por enzimas y depende de la luz.

2. Reparación de escisión:

En este mecanismo de reparación, el segmento dañado o alterado de la cadena de ADN se escinde y se sintetiza un nuevo parche de ADN en su lugar. Aunque los sistemas de reparación por escisión varían en su especificidad, la vía principal involucra los siguientes tres pasos:

(i) Reconocimiento e Incisión:

La sección dañada / alterada de una cadena de ADN es reconocida por una endonucleasa; esta enzima luego corta la hebra afectada en ambos lados del daño.

(ii) Escisión:

Una 5 '-> 3' exonucleasa (ADN polimerasa I) digiere la sección dañada / alterada; esto genera una región monocatenaria en la doble hélice del ADN.

(iii) Síntesis:

En esta etapa, la región monocatenaria producida por escisión sirve como plantilla para una ADN polimerasa que sintetiza el reemplazo para el segmento escindido. La ADN ligasa luego sella la muesca que queda después de la síntesis del reemplazo para la sección escindida.

En E. coli, la escisión es más probable debido a la actividad exonucleasa 3 '-> 5' de la ADN polimerasa I, mientras que la síntesis se realiza mediante la actividad polimerasa 5 '-> 3' de la misma enzima. Los sistemas de reparación por escisión son bastante comunes tanto en procariotas como en eucariotas. Algunos de estos sistemas reconocen el daño general al ADN, mientras que otros son muy específicos, por ejemplo, las endonucleasas AP eliminan los residuos de ribosa de los sitios de depuración. La reparación por escisión implica diferentes longitudes de ADN y se agrupa en las siguientes tres clases:

(a) Reparación de parches muy cortos (VSP):

Este sistema se ocupa de la reparación de desajustes entre bases específicas.

(b) Reparación de parches cortos:

En este sistema, se extirpan cadenas de ADN de aproximadamente 20 bases y los daños se reparan a través de los genes uvr (uvr, A, B, C, de E.coli), que codifican los componentes de una endonucleasa de reparación. También se necesita otra enzima uvr D para la actividad helicasa.

(c) Reparación de parches largos:

Este sistema implica la escisión de aproximadamente 1500 bases de segmentos largos, pero a veces el segmento extirpado puede ser> 9000 bases. Es mucho menos común y tiene que ser inducido por un daño que bloquea la replicación. En E. coli, este sistema también involucra los genes uvr y la ADN polimerasa I.

3. Reparación de desajuste:

Implica la corrección de desajustes o el emparejamiento entre bases que no son complementarias. Los desajustes pueden surgir (a) durante la replicación o (b) debido a alteraciones de la base (p. Ej., Desaminación de citosina a uracilo) y dan como resultado distorsiones estructurales en la doble hélice del ADN. Estas alternancias se manejan en E. coli mediante el sistema de reparación por escisión de parche muy corto que se describe a continuación.

Sistema de reparación de desajustes en E. coli:

Cuando hay una falta de coincidencia en un par de bases como en GC -> GT, entonces teóricamente puede reparar para dar lugar a un tipo salvaje (GC) o a un tipo mutante (AT). Por lo tanto, el sistema de reparación debe distinguir entre los hilos nuevos y antiguos y reparar solo el nuevo para restaurar el tipo salvaje.

Esto se realiza mediante un sistema de reparación por escisión de parche muy corto y requiere cuatro proteínas: Mut L, Mut S, Mut U y Mut H codificadas en E. coli, respectivamente, por los genes mut L, mut S, mut U y mut H. Los errores de falta de coincidencia producidos durante la replicación son corregidos por el sistema de reparación de la presa.

El gen de E. coli produce una metilasa que metila la adenina de la secuencia GATC en ambas cadenas de ADN. La replicación de una secuencia de GATC completamente metilada produce una secuencia hemimetilada en la que los residuos A en las cadenas recién sintetizadas no están metilados.

El estado no metilado de esta secuencia diana se utiliza para identificar la nueva cadena; Las bases alrededor del sitio de desajuste en la nueva cadena se escinden y se sintetiza un reemplazo. El sistema involucra los productos de los genes mut L, mut S, mut H y uvr D.

Reparación de sistemas de recuperación:

Estos sistemas también se conocen como "reparación posterior a la replicación" o "reparación por recombinación". En E.coli, este sistema de reparación se basa en el gen rec A que produce la proteína Rec A. La proteína Rec A funciona en el intercambio de cadenas entre las moléculas de ADN durante la recombinación genética y también funciona en el intercambio de una sola cadena durante la reparación de la recombinación. Parece que hay dos vías rec A, una que involucra los genes rec B, C y la otra que involucra rec F.

Este sistema de reparación funciona cuando una distorsión estructural bloquea la replicación en el sitio dañado. Por ejemplo, los mutantes de E. coli deficientes en la reparación por escisión no podrán eliminar los dímeros de timina. En tal situación, la replicación avanza normalmente hasta los sitios dañados; la ADN polimerasa detiene la replicación de la cadena afectada y reinicia la replicación saltando más allá del sitio dañado.

La cadena complementaria se replica normalmente en el sitio dañado en la otra cadena. Por lo tanto, la replicación produce una progenie normal de molécula de ADN y una molécula que tiene el dímero de timina en una hebra y un largo espacio en su hebra complementaria. La progenie de la molécula de ADN con dímero de timina se perdería a menos que se repare llenando el espacio en una de sus cadenas.

Esto se logra mediante el intercambio de una sola hebra entre las dos moléculas de ADN de la progenie; La región de intercambio llena el vacío y es inducida por la proteína RecA. Como resultado de este intercambio, la molécula de progenie normal tiene una región monocatenaria que tiene una brecha. Esta brecha es reparada por la síntesis de ADN.

Sistema de tolerancia:

Estos sistemas se ocupan de los daños que bloquean la replicación normal en el sitio dañado, posiblemente permitiendo la replicación de los sitios dañados con una alta frecuencia de errores. Estos sistemas pueden ser particularmente importantes en los eucariotas, donde el tamaño del genoma es muy grande y, por lo tanto, es bastante improbable una reparación completa del daño.