Prueba de hierro de triple azúcar en bacterias para descubrir la capacidad de producir sulfuro de hidrógeno (con la figura)
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Trate de realizar la prueba de hierro con azúcar triple (prueba TSI), para averiguar la capacidad de una bacteria para utilizar uno o más de los tres azúcares, como la glucosa, la sacarosa y la lactosa, así como su capacidad para producir sulfuro de hidrógeno (H2 S), que reduce el hierro.
Principio:
Algunas bacterias tienen la capacidad de utilizar uno o más de los tres azúcares, como la glucosa, la sacarosa y la lactosa.
Si se utiliza uno o más de los tres azúcares (azúcares triples), se produce ácido, lo que reduce el pH cambiando el color del rojo fenol de rojo a amarillo.
Además, algunas bacterias tienen la capacidad de producir sulfuro de hidrógeno (H2S) utilizando compuestos de azufre. El H 2 S así producido se combina con el compuesto de hierro, el sulfato ferroso, para formar precipitados negros de sulfuro ferroso.
En la prueba de hierro con triple azúcar (prueba TSI), las bacterias de prueba se cultivan en inclinaciones de agar que contienen glucosa, sacarosa, lactosa, rojo de fenol, tiosulfato de sodio y sulfato ferroso. Mientras que el medio contiene glucosa (es decir, D-glucosa o dextrosa) a una concentración baja de 0.1%, la concentración de sacarosa y lactosa se mantiene alta en 1%.
Si las bacterias tienen la capacidad de utilizar uno o más de los tres azúcares, el color del medio cambia de rojo a amarillo. Si las bacterias tienen la capacidad de producir H 2 S, el medio adquiere un color negro. Como se usan tres azúcares y un compuesto de hierro en el medio, la prueba se llama prueba de hierro de triple azúcar.
Materiales necesarios:
Tubos de ensayo, matraz cónico, tapones de algodón, aguja de inoculación, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente de eliminación, incubadora, agar con triple azúcar en hierro (TSI), colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.
Procedimiento:
1. Los ingredientes del medio de agar TSI (que contiene los 3 azúcares y el hierro como componentes principales) o su polvo ya preparado requerido para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml. agitando y girando (Figura 7.7).
2. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.4 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos.
3. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.
4. Antes de que se solidifique, el medio en estado fundido caliente se distribuye en 5 tubos de ensayo (aproximadamente 20 ml cada uno).
5. Los tubos de ensayo están tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.
6. Se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.
7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se mantienen en una posición inclinada para enfriar y solidificar el medio, a fin de obtener inclinaciones de agar TSI.
8. Las bacterias de prueba se inoculan de forma aséptica, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, en los tubos inclinados clavándolos en el extremo y rayándolos en la superficie de los tubos inclinados con la ayuda de una aguja esterilizada con flama. La aguja se esteriliza después de cada inoculación.
9. Los sesgos inoculados se incuban a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora.
Observaciones:
1. Tope amarillo e inclinación roja con o sin producción de gas (se rompe en el tope de agar):
Se ha formado culata ácida y inclinación alcalina. Aquí solo la glucosa se ha utilizado de forma anaeróbica (fermentativa), lo que hace que el trasero sea ácido (amarillo). No se ha utilizado ningún otro azúcar. Debido a que la concentración de glucosa es menor (0.1%), la pequeña cantidad de ácido producido en la superficie inclinada se oxida rápidamente haciéndolo alcalino (rojo).
Además, la dominación oxidativa de la peptona presente en el medio produce NH Y, lo que hace que la inclinación sea alcalina (roja). Sin embargo, en la culata, la condición ácida se mantiene debido a la disponibilidad reducida de oxígeno y al crecimiento más lento de las bacterias. Así, la bacteria es glucosa positiva.
2. Tope amarillo e inclinación amarilla con o sin producción de gas:
El extremo ácido y la inclinación ácida se han formado. Aquí, la lactosa y / o sacarosa han sido fermentados. Dado que su concentración en el medio es alta, producen una gran cantidad de ácidos que dan como resultado una inclinación ácida y un extremo ácido y mantienen la condición ácida. Por lo tanto, la bacteria es sacarosa / lactosa positiva.
3. Culo rojo y inclinación roja:
Ninguno de los tres azúcares ha sido fermentado. En cambio, las peptonas han sido catabolizadas en condiciones anaeróbicas y / o aeróbicas, lo que resulta en una condición alcalina debido a la producción de amoníaco.
Si solo ocurre una degradación aeróbica de las peptonas, solo la superficie inclinada se vuelve alcalina (roja). Si hay degradación aeróbica y anaeróbica de la peptona, tanto la inclinación como la culata se vuelven alcalinas (rojas). Por lo tanto, la bacteria es azúcar negativa.
4. Ennegrecimiento de la culata:
Además de cualquiera de las condiciones anteriores, si se produce un ennegrecimiento del trasero, indica que la bacteria es capaz de producir H2S utilizando el azufre inorgánico (tiosulfato de sodio) presente en el medio.
El H 2 S se combina con el sulfato ferroso en el medio para formar precipitados negros de sulfuro ferroso, lo que resulta en un cambio en el color del medio a negro. Así, las bacterias son H 2 S positivas.
5. Sin ennegrecimiento de tope:
La bacteria no es capaz de producir H2S utilizando el azufre inorgánico (tiosulfato de sodio) presente en el medio. Por lo tanto, la bacteria es H 2 S negativa.
