Tinción de esporas de bacterias para diferenciar esporas bacterianas y células vegetativas

Propósito:

Todas las bacterias permanecen en sus 'formas vegetativas', si las condiciones ambientales son favorables para sus actividades metabólicas normales.

De esta forma, absorben nutrientes, crecen y se reproducen.

Por otro lado, la mayoría de ellos mueren cuando las condiciones ambientales se vuelven adversas, como frío severo, calor extremo, envejecimiento, falta de nutrientes, exposición a la radiación y químicos tóxicos.

Sin embargo, pocas especies de bacterias pueden sobrevivir bajo tales condiciones adversas al cambiarse a formas altamente resistentes, metabólicamente inactivas llamadas "esporas". En condiciones adversas, una espora se produce dentro de una célula vegetativa por deshidratación y contracción de sus contenidos celulares.

Esta espora, formada dentro de la célula bacteriana, se llama "endospora" (Figura 2.13). Si las condiciones adversas empeoran, la célula se rompe, liberando la endospora, que ahora se convierte en una célula inactiva independiente llamada 'espora'.

El proceso de formación de esporas se llama 'esporogénesis'. La espora tiene capas gruesas y relativamente impermeables, como la corteza de esporas y la capa de esporas, que protegen a la célula de cualquier daño físico. La espora gana su resistencia por varios mecanismos, que aún no se han explicado claramente.

Cuando las condiciones se vuelven favorables, las capas que cubren la ruptura de la espora y la espora dan lugar a una célula vegetativa metabólicamente activa. Este proceso se llama 'germinación'.

Por lo tanto, según la capacidad de formar esporas, las bacterias se pueden dividir en dos grupos de la siguiente manera:

(1) Bacterias formadoras de esporas (formadores de esporas):

Una bacteria, que puede producir una espora para sobrevivir en condiciones ambientales adversas, es una bacteria formadora de esporas (formadora de esporas). Principalmente, los siguientes tres géneros de bacterias con forma de bastón pueden producir esporas en condiciones ambientales adversas.

A. Bacterias aerobias en forma de varilla

1. Bacillus spp.

B. Bacterias anaerobias en forma de bastón.

2. Clostridium spp.

3. Desulfotomaculum spp.

(2) Bacterias no formadoras de esporas (no formadoras de esporas):

Una bacteria, que no puede producir una espora y, por lo tanto, muere en su forma vegetativa en condiciones ambientales adversas, es una bacteria que no forma esporas (formadora de esporas).

El propósito de la tinción de esporas es diferenciar las esporas y las células vegetativas de un formador de esporas y diferenciar los formadores de esporas de los no formadores de esporas. La tinción de esporas también es útil para la identificación de las bacterias que pertenecen a los géneros Bacillus, Clostridium y Desulfotomaculum.

Principio:

Las esporas son diferentes de las células vegetativas en que poseen capas gruesas y relativamente impermeables a su alrededor (Figura 2.14). La mancha primaria, verde de malaquita, no puede penetrar en las esporas a través de estas capas.

Por lo tanto, la penetración de la mancha primaria se incrementa con la aplicación de calor, que lo impulsa a través de las capas de cobertura hacia el protoplasto de esporas. Ahora, las esporas aparecen verdes. Cuando las esporas se tratan con el agente decolorante, el agua del grifo, no se someten a decoloración, ya que excluyen el agua.

El agua del grifo elimina solo el exceso de mancha primaria presente en el entorno de las esporas. Así, las esporas conservan el color verde. Posteriormente, cuando se tiñe a la inversa con safranina, las moléculas de safranina no pueden entrar en las esporas a través de las capas de cobertura. Así, finalmente, las esporas retienen el color verde de la mancha primaria y aparecen verdes.

Por otro lado, las células de bacterias vegetativas absorben la mancha primaria, verde malaquita, fácilmente, pero la mancha no tiene una fuerte afinidad por los componentes de las células vegetativas, debido a que se lava, cuando se decolora con agua corriente.

Ahora, las células vegetativas aparecen incoloras. Cuando se tiñe de nuevo con safranina, las células vegetativas incoloras absorben la mancha y aparecen rojas a diferencia de las esporas, que aparecen verdes.

Materiales necesarios:

Deslizamiento, bucle, verde de malaquita, safranina, bacterias formadoras de esporas, placa caliente, microscopio, aceite de inmersión.

Procedimiento:

1. Una diapositiva se limpia adecuadamente con agua del grifo, de manera que el agua no quede como gotas en su superficie.

2. El agua adherida se limpia con papel absorbente y el portaobjetos se seca al aire.

3. Se realiza un frotis de bacterias formadoras de esporas en el centro de una diapositiva en los dos métodos que se indican a continuación.

(una) Si se observa un formador de esporas sobre una placa de agar o una inclinación de agar, se coloca una gota de agua en el centro de la diapositiva. Un bucle se esteriliza a la llama y un bucle de Clostridium de bacterias de una placa envejecida o un cultivo inclinado (48-72 horas) de formador de esporas, como Clostridium supergenes o Bacillus subtilis, se transfiere a la gota de agua.

Luego, mediante una suave rotación del bucle en la gota de agua, se hace una suspensión de bacterias y la gota se extiende hasta que se obtiene un frotis. A medida que aumenta la edad de las bacterias formadoras de esporas en los cultivos en placa o inclinados, forman esporas.

(segundo) Si se observa el formador de esporas cultivadas en caldo líquido, el cultivo del caldo, que contiene solo células vegetativas, se somete a estrés por calor, calentándolo en un baño de agua durante 15 minutos, de modo que algunas de las células vegetativas formen esporas para superar la estrés calórico. Una gota de la suspensión celular mixta de esporas y vegetales del caldo se coloca directamente en el centro del portaobjetos mediante un bucle estéril y se hace un frotis extendiendo.

4. El frotis se seca al aire.

5. El frotis se fija por calentamiento. El calentamiento da como resultado la coagulación de las proteínas celulares, debido a que las células se adhieren a la superficie del portaobjetos y no se lavan durante la tinción. La fijación por calor se realiza al pasar rápidamente el portaobjetos por encima de una llama 2-3 veces, con el frotis. Superficie orientada hacia arriba, para que el frotis no se caliente.

6. El frotis se inunda con la mancha primaria, verde malaquita.

7. El portaobjetos se mantiene en una placa caliente y la preparación se deja cocer al vapor durante 2-3 minutos. La temperatura de la placa calefactora se ajusta de manera que la preparación no hierva y se evapore rápidamente. La pérdida de evaporación se repone, de modo que el frotis no se seque.

8. El portaobjetos se retira de la placa caliente y se enfría.

9. El frotis se decolora lavándolo con agua del grifo que fluye suavemente, de tal manera que el agua no caiga directamente sobre el frotis.

10. El frotis se inunda con la contra-mancha, safranin, durante 30 segundos.

11. El exceso de teñido se elimina completamente de la mancha con agua del grifo que fluye suavemente, de manera que el agua no caiga directamente sobre la mancha.

12. El portaobjetos se secó con un papel absorbente.

13. La diapositiva se sujeta a la etapa del microscopio y se observa el frotis en los objetivos de baja potencia y alta sequedad.

14. Una gota de aceite de inmersión se coloca en el frotis.

15. El frotis se observa bajo el objetivo de inmersión en aceite.