Avances recientes en el diagnóstico de la malaria

Avances recientes en el diagnóstico de la malaria - HL Gupta, VK Talwar, A Rohtagi!

Introducción:

En la India, la malaria es un importante problema de salud; ha habido brotes frecuentes en Rajasthan y en los estados del noreste. En la incidencia de Rajastán, P. falciparum está en aumento. En Delhi, P. vivax es la especie más común, pero también se encuentra P. falciparum. La malaria, un problema mundial, mata entre 1, 5 y 2, 7 ​​millones de personas cada año. En otras palabras, mata a una persona (a menudo un niño <5 años) cada 12 segundos. Además, entre 300 y 500 millones de personas se infectan con la enfermedad cada año.

Para el control de la enfermedad el diagnóstico rápido y preciso es lo más importante. El diagnóstico de la malaria a menudo se realiza solo en función de los síntomas clínicos, aunque su precisión es, en el mejor de los casos, del 50%. Ahora están disponibles técnicas de diagnóstico más nuevas y avanzadas. Las investigaciones recientemente introducidas basadas en inmunoensayos son rápidas (<10 min / prueba) y al menos tan sensibles como la microscopía tradicional.

Microscopía de luz: frotis de sangre gruesa y fina:

El procedimiento de laboratorio tradicionalmente aceptado para el diagnóstico de la malaria ha sido el examen microscópico de frotis Giemsa o frotis teñido en el campo. Idealmente, la sangre debe obtenerse mediante un pinchazo en el dedo; sin embargo, la sangre obtenida por venopunción y anticoagulante (EDTA o heparina) es aceptable si se examina de inmediato. Se deben hacer frotis tanto gruesos como finos. El frotis grueso, concentra los glóbulos rojos 20 a 30 veces en una superficie pequeña, aumenta la sensibilidad de la técnica y es mucho mejor que los frotis finos. El frotis delgado sin embargo, es más específico.

Es el estándar de oro aceptado para el diagnóstico, pero requiere mucha mano de obra y la interpretación de los resultados requiere una experiencia considerable, especialmente con parasitemia baja. Además, los parásitos P falciparum que a menudo son secuestrados lejos de la sangre periférica pueden fácilmente pasarse por alto.

Cuantificación de parásitos mediante examen de frotis de sangre:

Existen muchos métodos para cuantificar los parásitos de la malaria en frotis gruesos. Los niveles de parásitos también se pueden cuantificar mediante el examen de un frotis de sangre delgada. Una desventaja importante de los frotis gruesos es que a menudo requiere un cierto grado de experiencia que puede no estar disponible.

En teoría, el examinador debe contar los campos de frotis gruesa que contienen 20 o más leucocitos / hpf. En realidad, los campos que contienen 20 o más leucocitos son demasiado gruesos para contarlos, mientras que los campos que son más fáciles de leer son aquellos que contienen solo cinco o seis leucocitos / hpf.

Antes de la tinción, el examinador debe poder leer la impresión a través de un frotis de sangre espeso y bien preparado. El examen de frotis finos es solo una décima tan sensible como el examen de frotis gruesos. Por lo tanto, aunque el examen de los frotis de sangre es aceptable como el "estándar de oro" universal, en realidad no existe un método único y estándar, utilizado por todos los investigadores, para la cuantificación de parásitos mediante el recuento de parásitos en frotis gruesos.

Además, bajo el personal capacitado, la falta de microscopios limita la utilidad del examen de frotis de sangre en muchas áreas endémicas. Reconociendo estas limitaciones, se han desarrollado técnicas alternativas para el diagnóstico de la malaria.

Microscopía de fluorescencia:

Tres técnicas fluorescentes son prometedoras para el diagnóstico de la malaria.

Estos son:

(i) El método cuantitativo de capa lustrosa (OBC) que está disponible como un kit comercial

(ii) El proceso de Kawamoto Acridine Orange (AO) y

(iii) Procedimiento de benzotiocarboxipurina (BCP).

Estas tres técnicas son rápidas y fáciles de realizar; cuando hay más de 100 parásitos / µL, demuestran una sensibilidad y especificidad equivalentes a las logradas mediante el examen de frotis grueso.

Tanto los métodos de OBC como los de Kawamoto utilizan naranja de acridina (AO) como el fluorocromo para teñir los ácidos nucleicos de los parásitos de la malaria en una muestra. BCP también es un fluorocromo, que tiñe ácidos nucleicos. AO es inespecífico y tiñe ácidos nucleicos de todos los tipos de células.

En consecuencia, el examinador debe aprender a distinguir los parásitos teñidos con fluorescencia de otras células y desechos celulares. La sensibilidad de la tinción de AO con niveles de parásitos de menos de 100 parásitos / µL ha sido de 41.7 a 93 por ciento.

La especificidad de la tinción AP para P. vivax y P. falciparum es de 52 y 93 por ciento, respectivamente. El método BCP tiene una sensibilidad y especificidad de más del 90 por ciento. Una limitación importante de los métodos basados ​​en AO y BCP es su incapacidad para diferenciarse entre las especies de Plasmodium. AO es peligroso y requiere requisitos especiales de eliminación.

OBC y el BCP son técnicamente más exigentes que Kawamoto. Los métodos de Kawamoto y AO requieren equipo y suministros especiales y son más caros. El precio de un microscopio de fluorescencia podría ser un factor limitante para los laboratorios interesados ​​en utilizar estos métodos.

Detección de secuencias específicas de ácido nucleico:

La detección de secuencias de ácido nucleico específicas para parásitos de Plasmodium puede ser útil. En las técnicas basadas en PCR, la secuencia diana amplificada se detecta mediante sondas internas o se analiza mediante electroforesis en gel. La principal ventaja de utilizar una técnica basada en PCR es la capacidad de detectar una "parasitemia baja". Las infecciones con parásitos vivos se pueden detectar con una especificidad del 100%.

Sin embargo, tales técnicas son costosas y requieren mucha mano de obra, requieren una amplia experiencia técnica, implican múltiples pasos y no pueden utilizarse para distinguir entre organismos viables y no viables.

Los inhibidores de la PCR presentes naturalmente en las muestras de sangre pueden dar como resultado un número significativo de resultados falsos negativos. También se han registrado resultados positivos falsos debido a la contaminación por arrastre.

Se han utilizado técnicas basadas en PCR para evaluar a los donantes en un área donde la malaria es endémica. La sensibilidad y especificidad de los métodos basados ​​en PCR, estimados mediante el examen de frotis de sangre como el "estándar de oro", son cada 90% o más.

Además, los avances adicionales en la tecnología de PCR pronto permitirán distinguir los parásitos viables de los no viables. En la actualidad, la utilidad de dicha tecnología está limitada por la necesidad de equipos de laboratorio costosos y especializados, personal capacitado en tecnologías genéticas e instalaciones de "sala limpia", y por un alto costo de las enzimas y los cebadores utilizados.

Detección de antígeno:

Las pruebas de detección de anticuerpos contra la malaria tenían una sensibilidad limitada y su capacidad para distinguir las infecciones activas de las anteriores. Las pruebas de captura de antígenos de la nueva generación son capaces de detectar menos parásitos y producir resultados rápidos (10 -15 min). Son kits disponibles comercialmente, que incluyen todos los reactivos necesarios, y no requieren entrenamiento ni equipo extensos.

Hay dos antígenos parásitos utilizados en las nuevas pruebas diagnósticas rápidas, la proteína 2 rica en histidina (HRP-2), que solo se produce por P. falciparum y el antígeno parásito lactato-deshidrogenasa (pLDH), producido por los cuatro Especies plasmodium infectando al hombre. Ambos antígenos son secretados en la sangre por todas las etapas asexuales del parásito; El antígeno pLDH también es producido por los gametocitos.

Las últimas pruebas de captura de antígenos son rápidas y sencillas de realizar, y tienen límites de detección comparables con los de la microscopía de alta calidad (es decir, 100-200 parásitos / µL). Cuando hay más de 60-100 parásitos / µL, el HRP 2 pruebas basadas son altamente (> 90%) sensibles y (> 90%) específicas, cuando se comparan con microscopía de frotis gruesa.

Actualmente, dos de estas pruebas están disponibles comercialmente, la prueba ParaSight F y la prueba de malaria (inmunocromatografía) de la malaria. Ambas pruebas se realizan en muestras pinchadas con el dedo y solo detectan malaria por P. falciparum.

Se basan en anticuerpos monoclonales contra HRP-2, que se inmovilizan en tiras de nitrocelulosa, para producir tiras reactivas o pruebas de cartón (prueba Pf de ICT). En cada prueba, se indica un resultado positivo mediante la aparición de una línea roja en la tira de prueba, donde se inmovilizan los anticuerpos monoclonales.

Ambas pruebas también contienen un control incorporado; debe aparecer una línea de control para que una prueba se considere válida. La sensibilidad y la especificidad de la prueba ParaSight F son 88 y 97 por ciento, respectivamente, comparables con la PCR.

Aunque las pruebas serológicas basadas en HRP-2 han permitido un diagnóstico rápido de la malaria falciparum, tienen una utilidad limitada. Dado que la HRP-2 solo está presente en P. falciparum, las pruebas basadas en la detección de HRP-2 son negativas con la infección causada por vivax, ovale o malaria.

Muchos casos de paludismo no falciparum, por lo tanto, serán mal diagnosticados como paludismo negativos. Otra limitación de las pruebas basadas en HRP-2 es que la HRP-2 persiste en la sangre mucho después de que los síntomas clínicos hayan desaparecido y los parásitos aparentemente se hayan eliminado del huésped.

De hecho, HRP-2 se ha descubierto en momias. Por lo tanto, las pruebas para este antígeno pueden no ser útiles para detectar a las personas indígenas de áreas endémicas, que pueden tener parasitemia persistente y de bajo nivel. La posible razón de la persistencia del antígeno HRP-2 no se conoce bien; puede reflejar la presencia de parásitos viables y latentes (posiblemente como resultado del fracaso del tratamiento) o de complejos solubles antígeno-anticuerpo.

La persistencia también puede depender del tipo de terapia antipalúdica instituida. La señal HRP-2 puede persistir durante 19 días después de una terapia de quinina y doxiciclina aparentemente efectiva. También se ha observado antigenemia HRP-2 persistente durante y después del tratamiento con artemeter.

Otras limitaciones están específicamente relacionadas con los aspectos técnicos del sistema HRP-2. Por ejemplo, la IgG monoclonal utilizada en el sistema ParaSight F puede reaccionar de forma cruzada con el factor reumatoide y provocar una respuesta positiva falsa.

La prueba ICT Pf utiliza una IgM monoclonal, que no reacciona de forma cruzada y no hay informes de reacciones falsas positivas que se produzcan con esta prueba debido al factor reumatoide. Sin embargo, la prueba ICT Pf requiere un almacenamiento a 4 ° C, lo que limita su utilidad en situaciones de campo.

Ensayos serológicos basados ​​en pLDH:

Las nuevas pruebas serológicas rápidas para el diagnóstico de malaria se basan en la detección de pLDH. Al igual que los ensayos basados ​​en HRP-2, estas pruebas son sensibles, específicas y fáciles de realizar, con resultados que se pueden obtener en menos de 15 minutos.

Los ensayos basados ​​en pLDH también son capaces de diferenciar entre P. falciparum y otras especies de Plasmodium y, dado que la pLDH solo es producida por parásitos viables, también son útiles en el monitoreo de la terapia contra la malaria. pLDH de P. falciparum se diferencia del anfitrión LDH (h-LDH) con el dinucleótido adenina 3-acetilpiridina (APAD), un análogo del dinucleótido adenina nicotinamida (NAD).

Los ensayos basados ​​en pLDH están disponibles en dos formas, una tira reactiva semicuantitativa y seca (OptiMAL); y un ensayo de captura cuantitativo, inmunoenzimático. El ensayo OptiMAL utiliza dos anticuerpos monoclonales, uno específico para P. falciparum y el otro que reconoce los 4 Plasmodia.

La muestra de sangre analizada (10 µL de punción en el dedo, sangre completa o hemolizado congelado) se mezcla con 3 µ µL, un tampón de lisis que contiene un anticuerpo monoclonal conjugado. Esta mezcla se deja remojar en la varilla de medición OptiMAL.

Después de 3 minutos, se añaden 100 µl de tampón de eliminación. Si P. falciparum está presente en la muestra de sangre, se desarrollan tres líneas (incluyendo una, en la parte superior de cada barra, que representa el control positivo) en tiras reactivas.

Dos líneas indican P. vivax, P. malariae u ocasionalmente, P. ovale. Una tira OptiMAL-2 con formato nuevo tiene tres líneas de prueba y una línea de control positivo, que permite identificar las cuatro especies de Plasmodium.

Cada prueba solo se considera ualid si se desarrolla una línea de control. Los anticuerpos monoclonales utilizados en la prueba OptiMAL se han probado exhaustivamente para determinar la reactividad cruzada con LDH de leishmania, babesia y bacterias u hongos patógenos y no se ha encontrado evidencia de tal reactividad cruzada.

Se encontró que la HRP-2 persistía bien después de que la parasitemia periférica había desaparecido. Aunque los niveles de pLDH siguen de cerca la parasitemia periférica y cayeron a valores indetectables 3-5 días después de la terapia con quinina y doxiciclina, los niveles de antígeno HRP-2 solo disminuyeron después de 19 días, mucho después de que el paciente tiene síntomas y aparentemente no tiene parásitos.

Por lo tanto, el ensayo OptiMAL debería ser una herramienta valiosa en el monitoreo de la terapia contra la malaria. La eliminación de la parasitemia y la eliminación de pLDH parecen ser paralelas entre sí.

Los ensayos ópticos, son muy versátiles. La prueba OptiMAL tiene sensibilidades de 94 a 88% respectivamente y una especificidad de 100 y 99% para P. vivax y P. falciparum, respectivamente, en comparación con frotis de sangre.

Esta prueba se puede usar como una herramienta epidemiológica ya que, en áreas donde más de una especie de Plasmodium está circulando, se puede usar para identificar las especies de Plasmodium que infectan a los pacientes en cada aldea rápidamente y permitir que los trabajadores de salud pública administren la quimioterapia más adecuada .

Conclusiones:

En los últimos años, los esfuerzos para reemplazar la lectura tradicional y tediosa de frotis de sangre (un método desarrollado hace casi 100 años) han llevado a técnicas para la detección de parásitos de la malaria que producen sensibilidades equivalentes o mejores que la microscopía.

Si bien los métodos basados ​​en PCR son posiblemente los más sensibles, son tan costosos y requieren equipo y capacitación tan especializados que es poco probable que se utilicen para el diagnóstico de rutina en la mayoría de los países en desarrollo.

Son particularmente útiles para estudios sobre diferencias de cepas, mutaciones y genes involucrados en la resistencia a los medicamentos en el parásito, y para mostrar el nivel de parentesco entre las cepas asociadas con diferentes brotes de malaria. Lo más prometedor, los nuevos diagnósticos de malaria son las pruebas serológicas.

Estas pruebas, que incluyen ParaSight F, ICT Pf Test y OptiMAL, son fáciles de usar, fáciles de interpretar y producen resultados en 15 minutos o menos. Estas pruebas son casi tan sensibles como el examen microscópico de frotis de sangre, pero no requieren personal altamente calificado para realizar o interpretar los resultados.

La prueba OptiMAL tiene las ventajas adicionales de poder detectar las cuatro especies de Plaspiodium y seguir la eficacia de la terapia con medicamentos, ya que mide una enzima producida solo por parásitos vivos.

Si bien las pruebas de la varilla de medición tienen dos limitaciones obvias, ninguna de las dos debe evitar una aceptación generalizada. La primera limitación es la de la sensibilidad. Los tres ensayos comercializados actualmente tienen umbrales de sensibilidad de 50-100 parásitos / µ1. La sensibilidad para muestras con <50 parásitos / µL es constantemente del 50% al 70%.

Este nivel de sensibilidad puede no ser un gran problema para quienes viven permanentemente en áreas endémicas, quienes a menudo no reciben tratamiento a menos que tengan más de 500 parásitos / µL de sangre, pero pueden plantear un problema en el diagnóstico de malaria en aquellas personas que son de áreas no endémicas, pero viven, trabajan o viajan en áreas endémicas.

Sin embargo, como la gran mayoría de los pacientes con malaria tienen niveles de parásitos muy por encima de 50 parásitos / µL, pocos pacientes serían diagnosticados erróneamente si las pruebas de la tira reactiva se usaran habitualmente. La segunda limitación de tales pruebas, al menos actualmente, es su costo.

La Organización Mundial de la Salud considera que, para aquellos que se encuentran en áreas endémicas para aprovecharlas, las pruebas de diagnóstico para la malaria deberían costar menos de US $ 0.40 por muestra. A menos que las pruebas de la varilla de medición se produzcan en cantidades masivas, este precio es inalcanzable y no es práctico para que los fabricantes puedan cumplir.

Los costos actuales de las pruebas de la varilla dependerán de la ubicación del comprador y del volumen solicitado. Por ejemplo, los costos de las Pruebas Pf de ICT varían desde US $ 1.30 / prueba en los países en desarrollo. Las pruebas Para 0Sight F se venden a US $ 1.20 por prueba. La tira óptica actualmente se vende a US $ 3.00 / prueba.