Prueba de oxidasa en bacterias para determinar su capacidad para oxidar el citocromo reducido C

Lea este artículo para obtener información sobre la prueba de oxidasa en bacterias para descubrir su capacidad para oxidar el citocromo reducido C:

Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de oxidasa 'reduciendo el citocromo C' presente en sus células a 'citocromo C oxidado', ya que pueden producir la enzima 'citocromo oxidasa'.

El citocromo C oxidado produce un color púrpura (púrpura de Wurster) con el colorante N-tetrametil-para-fenilendiamina (es decir, reactivo de oxidasa).

En la prueba de oxidasa, las placas de agar nutritivo que contienen las colonias de las bacterias de prueba se inundan con la solución de reactivo de oxidasa. Si las bacterias tienen la capacidad de producir la enzima citocromo oxidasa, el color de las colonias en las placas cambia a púrpura. Si las bacterias no tienen la capacidad de producir citocromo oxidasa, las colonias conservan el color rosado original del reactivo de oxidasa.

Materiales necesarios:

Placas de Petri, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación de alambre de platino, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente, incubadora, tira de papel filtro Whatman, reactivo de oxidasa (N-tetrametil-para-fenilendiamina), agar nutriente, colonias aisladas o Culturas puras de bacterias.

Procedimiento:

(a) Método de la placa:

1. Se limpian dos placas de petri, se cubren con papel artesanal y se atan con hilo o banda de goma (Figura 7.19). Estos pasos, así como la esterilización de las placas de petri en el paso 6 se omiten, si se utilizan directamente placas de petri esterilizadas en horno.

2. Los ingredientes del medio de agar nutriente o su polvo listo para su uso requerido para 100 ml del medio se pesan y disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando.

3. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.0 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos.

4. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.

5. El matraz está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

6. Las dos placas de Petri y el matraz cónico que contiene medio de agar nutriente se esterilizan a 121 ° C (presión de 15 psi) durante 15 minutos en un autoclave.

7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se dejan enfriar durante algún tiempo, sin dejar que el medio se solidifique. El enfriamiento del medio evita la condensación y la acumulación de gotas de agua dentro de las placas. Si el medio ya ha sido preparado y solidificado durante el almacenamiento, debe licuarse calentándolo cuidadosamente hasta que se derrita por completo.

8. Para preparar las placas de agar nutritivo, antes de que el medio de agar nutriente esterilizado se enfríe y se solidifique, en estado fundido caliente, se vierte asépticamente, preferiblemente dentro de una cámara de flujo laminar, en las dos placas petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada una), de modo que El medio fundido cubre completamente el fondo de las placas de Petri.

Luego, las placas se cubren con sus tapas y se dejan enfriar, para solidificar el medio en ellas. El vapor de agua que puede condensarse en la superficie interna de las placas y tapas se evapora manteniendo las placas y las tapas en posición invertida en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.

9. Cada placa está marcada en el lado inferior en cuatro cuartos.

10. La "inoculación puntual" de las bacterias de prueba se realiza de forma aséptica, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, en el centro de cada cuarto al hacer una mancha (o un pequeño borrón) de las bacterias con la ayuda de un bucle esterilizado por llama. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

11. Las placas inoculadas se incuban en posición invertida, de arriba abajo, a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora hasta que las colonias de las bacterias son visibles.

12. Las placas se inundan con reactivo de oxidasa.

(b) Método de papel:

1. Una tira de papel de filtro Whatman, sumergida en reactivo de oxidasa al 1% se seca y se mantiene en la oscuridad.

2. Antes de su uso, se humedece y se coloca un bucle de las bacterias de prueba como un punto con la ayuda de un bucle de alambre de platino. El bucle de nicrom puede oxidar el reactivo. Por lo tanto, el bucle de platino tiene que ser utilizado.

3. La mancha se observa después de 10 segundos.