Prueba de oxidasa en bacterias para descubrir su capacidad para hidrolizar gelatina mediante la producción de gelatinasa

Prueba de oxidasa en bacterias para descubrir su capacidad para hidrolizar gelatina mediante la producción de gelatinasa

Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar la gelatina, ya que pueden producir la enzima proteolítica 'gelatinasa'.

Mientras que la gelatina se precipita por el cloruro de mercurio que produce translucidez, sus productos finales hidrolizados no se precipitan por el cloruro de mercurio, por lo que no producen tal translucidez, sino que producen transparencia.

En la prueba de gelatinización, las bacterias de prueba se cultivan en placas de agar que contienen gelatina. Después de que las colonias de las bacterias son visibles, las placas se inundan con una solución de cloruro de mercurio. Si las bacterias tienen la capacidad de hidrolizar la gelatina, sus colonias hidrolizan la gelatina en el medio en las áreas que las rodean, mientras que el resto de las áreas de las placas retienen la gelatina no hidrolizada.

Como resultado, cuando se inunda con una solución de cloruro de mercurio, se forman zonas transparentes alrededor de las colonias, ya que los productos hidrolizados que se forman a su alrededor no forman precipitados con el cloruro de mercurio. Por otro lado, el resto de las áreas de las placas se vuelven translúcidas, ya que la gelatina no hidrolizada en estas áreas forma precipitados con cloruro mercúrico.

Materiales necesarios:

Placas de Petri, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente, incubadora, agar de gelatina de Fraizer, solución de cloruro de mercurio, colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.

Procedimiento:

1. Se limpian dos placas de petri, se cubren con papel artesanal y se atan con hilo o banda de goma (Figura 7.20). Este paso, así como la esterilización de las placas de Petri en el paso 6, se omiten si las placas de Petri esterilizadas en horno se utilizan directamente.

2. Los ingredientes del medio de agar de gelatina de Fraizer (que contiene gelatina como componente principal) o de su polvo prefabricado requerido para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando. .

3. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.2 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos.

4. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.

5. El matraz está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

6. Las dos placas de Petri y el matraz cónico que contiene medio de agar de gelatina de Fraizer se esterilizan a 121 ° C (presión de 15 psi) durante 15 minutos en un autoclave.

7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se dejan enfriar durante algún tiempo sin permitir que el medio se solidifique. El enfriamiento del medio evita la condensación y la acumulación de gotas de agua dentro de las placas. Si el medio ya ha sido preparado y solidificado durante el almacenamiento, debe licuarse calentándolo cuidadosamente hasta que se derrita por completo.

8. Para preparar placas de agar de gelatina, antes de que el medio de agar de gelatina de Frazier esterilizado se enfríe y solidifique, en estado fundido caliente, se vierte asépticamente, preferiblemente dentro de una cámara de flujo laminar, en las dos placas petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada una), por lo que Que el medio fundido cubra completamente el fondo de las placas de petri.

Luego, las placas se cubren con sus tapas y se dejan enfriar, para solidificar el medio en ellas. El vapor de agua que puede condensarse en la superficie interna de las placas y tapas se evapora manteniendo las placas y las tapas en posición invertida en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.

9. Cada placa está marcada en el lado inferior en cuatro cuartos.

10. La "inoculación puntual" de las bacterias de prueba se realiza de forma aséptica, preferiblemente dentro de una cámara de flujo laminar, en el centro de cada cuarto haciendo una mancha (o una pequeña muestra) de las bacterias con la ayuda de un bucle esterilizado por llama. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

11. Las placas inoculadas se incuban en posición invertida, de arriba a abajo, a 37 ° C durante 24 a 48 horas en una incubadora hasta que las colonias de las bacterias son visibles.

12. Las placas se inundan con una solución de cloruro de mercurio (HgCl ₂ ).