Prueba de Ortho-Nitrophenyl Galactoside en bacterias para encontrar su capacidad para hidrolizar Ortho-Nitrophenyl-PD-Galactoside

Lea este artículo para obtener información sobre el rendimiento de la prueba de orto-nitrofenil galactósido en bacterias para encontrar su capacidad para hidrolizar orto-nitrofenil-PD-galactosido.

Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de fermentar la lactosa. Se denominan 'bacterias que fermentan la lactosa' o 'fomentadores de la lactosa'.

Los otros, que no pueden fermentar la lactosa, se denominan bacterias no fermentadoras de la lactosa o "no fomentadores de la lactosa".

Las bacterias que fermentan la lactosa pueden producir dos enzimas, a saber, "permeasa" y "β-galactosidasa", que participan en la fermentación de la lactosa. La permeasa ayuda a la entrada de lactosa en las células bacterianas, mientras que la β-galactosidasa hidroliza la lactosa a glucosa y galactosa, la β-galactosidasa es una enzima inducible intracelular, cuya producción es inducida por la presencia de lactosa en el entorno de las células bacterianas.

Mientras que las bacterias que fermentan la lactosa pueden producir tanto la permeasa como la β-galactosidasa, las bacterias que no fermentan la lactosa no pueden producir la permeasa, pero pueden o no producir la β-galactosidasa. La prueba ONPG se realiza para determinar la capacidad de las bacterias no fermentadoras de la lactosa para producir β-galactosidasa.

Para esto, la membrana celular de las células bacterianas no fermentadoras de lactosa se disuelve agregando tolueno, para liberar todas las enzimas intracelulares, incluida la P-galactosidasa, si está presente. La enzima, β-galactosidasa, hidroliza el sustrato orto-nitrofenil-β-D-galctosido (ONPG) al orto-nitrofenol, que es de color amarillo.

En la prueba orto-nitrofenil galactósido (prueba ONPG), las bacterias de prueba se cultivan en inclinaciones de agar con triple azúcar y hierro (agar TSI), que contienen lactosa. Si las bacterias son de lactosa no fermentadas, como indican el extremo rojo y la inclinación del rojo, se prepara una suspensión espesa de la bacteria en solución salina, a la que se agrega tolueno seguido de una solución de ONPG. Si la bacteria tiene la capacidad de producir la enzima P-galactosidasa, el color de la suspensión de bacterias cambia a amarillo.

Materiales necesarios:

Tubos de ensayo, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación, aguja de inoculación, autoclave, quemador Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente de eliminación, incubadora, agar TSI, tolueno, o-nitrofenil-β-D-galactósido (ONPG), colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.

Procedimiento:

1. Los ingredientes del medio de agar TSI (que contiene los 3 azúcares y el hierro como componentes principales) o su polvo ya preparado requerido para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml. temblando y girando (Figura 7.16).

2. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.4 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos.

3. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.

4. Antes de que se solidifique, el medio en estado fundido caliente se distribuye en 5 tubos de ensayo (aproximadamente 20 ml cada uno).

5. Los tubos de ensayo están tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.

6. Se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.

7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se mantienen en una posición inclinada para enfriar y solidificar el medio, a fin de obtener inclinaciones de agar TSI.

8. Las bacterias de prueba se inoculan de forma aséptica, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, en los tubos inclinados clavándolos en el extremo y rayándolos en la superficie de los tubos inclinados con la ayuda de una aguja esterilizada con flama. La aguja se esteriliza después de cada inoculación.

9. Los sesgos inoculados se incuban a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora.

10. Si la bacteria es un fermentador de lactosa, no se selecciona para la prueba ONPG. Si la bacteria es lactosa no fermentadora, según lo indicado por el extremo rojo y la inclinación roja, se selecciona para la prueba ONPG.

11. En un tubo de ensayo que contiene 0, 25 ml de solución salina, se coloca un cultivo espeso de las bacterias por medio de un bucle esterilizado por llama, para formar una suspensión espesa de las bacterias.

12. Se agrega una gota de tolueno, se mezcla y se incuba durante 5 minutos a 37 ° C.

13. Se agrega una solución de O-nitrofenil galactósido (solución ONPG) y se incuba a 37 ° C durante 30 minutos. Luego se observa el cambio de color. Nuevamente se observa cambio de color después de 24 horas.

Observaciones:

1. Color amarillo producido: ONPG positivo.

2. Permanece incoloro: ONPG negativo.