Prueba de reducción de nitrato en bacterias para descubrir la capacidad de reducir nitratos

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Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de reducir los nitratos, ya que pueden producir la enzima 'nitrato reductasa'.

Esta enzima, en presencia de un donante de electrones adecuado, reduce los nitratos (N0 ₃ ^- ) a nitritos (N0 ₂ ^- ). La presencia de N0 ₂ ^- está indicada por ácido sulfanílico y a-naftilamina, que cambian el color a rojo.

En la prueba de reducción de nitrato, las bacterias de prueba se cultivan en un medio de caldo que contiene nitrato (N0 ₃ ^- ). Si la bacteria tiene la capacidad de reducir los nitratos, el caldo adquiere un color rojo al agregar ácido sulfanílico y a-naftilamina.

Si no se produce color rojo, indica que la bacteria N0 ₃ ^- no se reduce en absoluto o la bacteria produce una enzima nitrato reductasa altamente potente, que reduce rápidamente N0 ₃ ^- más allá de N0 ₂ ^- a NH ₃ y N ₂ . Para confirmar esto, se agrega una pequeña cantidad de polvo de zinc, que reduce el NO ₃ ^-, si está disponible en el medio, a N0 ₂ ^-, lo que produce un color rojo.

Por lo tanto, si se produce un color rojo, indica que N0 ₃ ^- está presente en el medio sin cambios y que la bacteria no tiene la capacidad de reducir los nitratos. Si no se produce color rojo, indica que, el N0 ₃ ^- se ha reducido más allá del N0 ₂ ^- a NH ₃ y N ₂ y la bacteria tiene la capacidad de reducir los nitratos.

Materiales necesarios:

Tubos de ensayo, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente, incubadora, caldo de nitrato, polvo de zinc, solución de reactivo de nitrato A, solución de reactivo de nitrato B, colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.

Procedimiento:

1. Los ingredientes del medio de caldo de nitrato (que contiene nitrato como componente principal) o de su polvo prefabricado requerido para 100 ml del caldo se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando ( Figura 7.10).

2. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.2 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos. El matraz se calienta, si es necesario, para disolver los ingredientes por completo.

3. El caldo se distribuye en cinco tubos de ensayo (aproximadamente 10 ml cada uno), tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.

4. Los tubos de caldo se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.

5. Los tubos de caldo se dejan enfriar a temperatura ambiente.

6. Las bacterias de prueba se inoculan asépticamente, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, en el caldo con la ayuda de un bucle de inoculación esterilizado sobre una llama Bunsen. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

7. Los tubos de caldo inoculados se incuban a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora.

8. Se añaden 0, 5 ml de cada solución reactiva de nitrato A (que contiene ácido sulfanílico) y solución reactiva de nitrato B (que contiene a-naftilamina) a cada tubo de ensayo, se agita bien y se observa un cambio de color después de 15 minutos.