Experimento para aislar el colifago de un virus (con diagrama)

Experimento para aislar el colifago de un virus!

Principio:

El bacteriófago o fago (virus) que infecta a la bacteria, Escherichia coli, se llama colifago (coli: E. coli-, fago: bacteriófago).

Se puede obtener de una variedad de fuentes naturales, como el suelo, la materia fecal y las aguas residuales sin tratar. Su aislamiento de estas fuentes no es muy fácil, ya que está presente en baja concentración.

Por lo tanto, primero se incrementa su número en una etapa de enriquecimiento, en la que se agrega un rico cultivo de las bacterias huésped (es decir, E. coli) a la muestra que contiene colifago y se incuba. El colifago infecta a E. coli y aumenta en número en abundancia. Este cultivo rico en colifagos se centrifuga para sedimentar la materia particulada.

El sedimento se desecha y el sobrenadante se filtra a través de un filtro microbiano para retener las bacterias y otras partículas, mientras se deja pasar el colifago. El filtrado, rico en colifagos, se usa para sembrar una suspensión de E. coli, que luego se deja crecer como un césped confluente en una placa de agar.

El colifago crece dentro de las células de E. coli y las liza. La lisis de las células bacterianas produce la formación de zonas claras en el césped confluente de las bacterias. Estas zonas claras se llaman placas. Se supone que cada zona despejada está formada por un solo colifago.

Materiales necesarios:

Pipetas, matraces cónicos, placas de Petri, tubos de ensayo, tapones de algodón, mechero Bunsen, depósito de residuos, centrifugadora, aparato de filtración de membrana, cámara de flujo laminar, autoclave, incubadora, caldo de bacteriófagos, agar blando de triptona, agar duro de triptona, cultivo de caldo nutritivo bacterias Escherichia coli (p. ej., E. coli B), muestra (p. ej., aguas residuales sin tratar).

Procedimiento:

1. Cinco pipetas (en una caja de pipetas de acero inoxidable) y cinco placas de Petri se esterilizan en un horno de aire caliente a 180 ° C durante 3 horas. Alternativamente, pueden cubrirse con papel para manualidades, atarse con hilo o banda de goma y esterilizarse en un autoclave junto con el medio (Figura 8.5).

2. Se pesan los ingredientes del medio de caldo de bacteriófagos o su polvo preparado, requerido para 100 ml del medio, se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml y el pH se ajusta a 7.6. El matraz está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

3. Se pesan los ingredientes del medio de agar blando de triptonona o su polvo preparado, requerido para 100 ml del medio, se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml y el pH se ajusta a 7, 5.

4. Este medio líquido se distribuye en 5 tubos de ensayo (2 ml cada uno), tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.

5. Los ingredientes del medio de agar duro triptona o su polvo listo para usar para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml calentando después de ajustar el pH a 7, 5. El matraz está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

6. El matraz que contiene el caldo de bacteriófagos, los 5 tubos de agar blando de triptona, el matraz que contiene medio de agar duro de triptonona y un matraz cónico de 250 ml tapado con algodón vacío se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.

7. El medio de agar duro de triptona esterilizado en el matraz cónico se vierte en las 5 placas petri esterilizadas de forma aséptica y se deja enfriar, para obtener 5 placas de agar duro de triptona.

8. En el matraz cónico vacío de 250 ml esterilizado y taponado con algodón, 5 ml de caldo de bacteriófago esterilizado, 5 ml de caldo de E. coli B y 45 ml de aguas residuales sin tratar se transfieren asépticamente, preferiblemente a una cámara de flujo laminar (Figura 8.6) .

9. El matraz se incuba a 37 ° C durante 24 horas, para permitir que el colifago en las aguas residuales prolifere dentro de las células de la bacteria huésped (células de E. coli B).

10. El contenido del matraz se vierte en tubos de centrífuga de 100 ml y se centrifuga a 2500 rpm durante 20 minutos en una centrífuga para depositar las partículas. El sedimento se desecha.

11. El sobrenadante, rico en colifagos, se filtra a través de un aparato de filtración de membrana. El residuo se desecha.

12. Los cinco tubos de agar blando de triptonona esterilizados se toman y se calientan en un baño de agua a 100 ° C, para fundir el agar. Los tubos se enfrían y se mantienen a 45 ° C en un baño de agua.

13. Usando una pipeta estéril, 1, 2, 3, 4 y 5 gotas del filtrado libre de bacterias, rico en colifagos se transfiere asépticamente a los cinco tubos de agar blando de triptona.

14. A cada tubo de agar blando de triptona, se transfieren asépticamente 0, 1 ml de un cultivo en caldo nutritivo de Escherichia coli B.

15. El contenido de los cinco tubos de agar blando de triptona que tienen el virus, el colifago y las bacterias, E. coli B se mezcla rápidamente girando los tubos entre las palmas de las manos.

16. El contenido se vierte sobre las cinco placas de agar duro de triptona (etiquetadas de 1 a 5 gotas), formando así una preparación de cultivo de placa de doble capa. Las placas se agitan suavemente y se dejan endurecer.

17. Las placas inoculadas se incuban en una posición invertida a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora.

Observaciones:

1. Todas las placas se observan para las unidades de formación de placa (PFU) que se desarrollan como zonas claras en el césped de las bacterias. La formación de placa es indicativa de la presencia de colifago en el cultivo.

2. Cada placa representa un rico crecimiento de colifagos aislados.

3. El número de placas se cuenta en todas las placas y se tabula de la siguiente manera (Tabla 8.1).

Tabla 8.1: Observaciones del número de colifagos :