Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) Métodos para detectar antígeno

Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) ¡Métodos para detectar el antígeno!

Se puede usar un método inmunoabsorbente ligado a enzimas para detectar el antígeno o el anticuerpo. El método ELISA tiene muchas ventajas sobre otros métodos (Tabla 27.2).

El método ELISA es 10 a 1000 veces más sensible que los métodos más antiguos, como la aglutinación y la inmunoelectroforesis. Una variedad de modificaciones de ELISA están disponibles, algunas de las cuales se describen aquí.

Tabla 27.2: Ventajas de los inmunoensayos enzimáticos

1. El efecto de amplificación de los resultados de las enzimas en el desarrollo de ensayos más sensibles

2. Los reactivos tienen una larga vida útil y son comparativamente baratos

3. Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones de ensayo.

4. El equipo es menos costoso y ampliamente disponible.

5. No hay riesgos de radiación

6. Se puede realizar en pequeños laboratorios también.

ELISA para Ensayo de Anticuerpos:

El antígeno conocido se cubre con una placa de microlitro (placa de plástico pequeña, tratada para maximizar la unión de proteínas; contiene 96 pocillos con un volumen de 200 µl).

Se agrega suero de prueba humano al pozo y se incuba.

yo. Si el suero contiene anticuerpos contra el antígeno recubierto, los anticuerpos se unen a los antígenos.

Los pocillos se lavan para eliminar los componentes de suero no unidos.

Se añade inmunoglobulina antihumana conjugada con enzimas (conocida como conjugado) a los pocillos y se incuba.

ii. El conjugado se une a los anticuerpos unidos al antígeno en el pozo.

iii. Si el suero de prueba no contiene anticuerpos contra el antígeno, el conjugado permanece en la solución.

Los pocillos se lavan para eliminar el conjugado no unido.

Se añade un sustrato adecuado a los pocillos y se incuba.

iv. La enzima del conjugado en el complejo antígeno-anticuerpo-conjugados actúa sobre el sustrato y divide el sustrato para producir un producto coloreado. El desarrollo del color indica que el anticuerpo específico para el antígeno recubierto en los pocillos está presente en el suero de prueba.

v. El no desarrollo de color indica que el suero de prueba no tiene anticuerpos contra el antígeno recubierto en los pocillos.

Se agrega una solución de parada (generalmente, ácido sulfúrico IN) para detener la reacción. Luego, la placa se mantiene en un lector ELISA y se mide la densidad óptica (OD) de los pocillos. La DO corresponde a la cantidad de anticuerpo en el suero de prueba.

Usando concentraciones conocidas de anticuerpos, se puede construir un gráfico. Las concentraciones de anticuerpos se representan en el eje X y las OD correspondientes se representan en el eje Y y se dibuja una curva. Al interpolar el valor de OD del suero de prueba, se determina la concentración de anticuerpos en un suero de prueba.

ELISA para Ensayo de Antígeno:

Un anticuerpo monoclonal conocido (denominado anticuerpo primario) contra un antígeno se reviste en los pocillos de microtitulación.

La muestra que se supone que contiene el antígeno se agrega al pozo y se incuba.

yo. Si la muestra contiene el antígeno correspondiente, el antígeno se une al anticuerpo en el pozo y forma un complejo antígeno-anticuerpo.

Los pozos se lavan para eliminar los materiales no unidos.

Un mAb conjugado con enzima conocido (llamado conjugado) contra el antígeno se agrega a los pocillos y la placa se incuba.

yo. Si el pozo contiene complejo antígeno-anticuerpo, el conjugado se une al antígeno en el complejo.

ii. Si no hay complejo antígeno-anticuerpo, el conjugado permanece en solución.

Los pocillos se lavan para eliminar el conjugado no unido. Se añade un sustrato adecuado y se incuba.

yo. Si hay conjugado en el pozo, la enzima del conjugado divide el sustrato y produce un producto coloreado.

iii. La ausencia de desarrollo de color indica que no hay antígeno en la muestra (contra el anticuerpo recubierto en los pocillos).

Se agrega una solución de parada para detener la reacción. Las OD de los pocillos individuales se leen en el lector ELISA. Como se explicó anteriormente, se construye una gráfica (que consiste en diferentes concentraciones de antígenos en el eje X y las OD correspondientes en el eje Y) y se dibuja la curva. La concentración del antígeno en la muestra de prueba se determina por interpolación de su OD.

Método ELISA de captura de anticuerpos:

Los pocillos de la placa de microtitulación están recubiertos con anticuerpos anti-IgM humanos.

Se agrega el suero del paciente y se incuba. Los anticuerpos IgM en el suero se unen a los anticuerpos IgM antihumanos en los pozos.

Los pocillos se lavan y luego se agrega un antígeno conocido y se incuba.

yo. Si los anticuerpos IgM contra el antígeno están presentes en el pozo, el antígeno se unirá al anticuerpo IgM y permanecerá en el pozo.

Los pocillos se lavan para eliminar el antígeno no unido.

Se añade una mAb conjugada con enzima al antígeno y se incuba.

yo. Si el antígeno está presente en el pozo (complejo anti-IgM-IgM-antígeno), el conjugado se unirá al antígeno.

Los pocillos se lavan para eliminar el conjugado no unido y se agrega el sustrato.

yo. El desarrollo del color indica que los anticuerpos IgM contra el antígeno están presentes en el suero del paciente.

ii. El no desarrollo del color indica que el suero del paciente no contiene anticuerpos IgM contra el antígeno.

Se agrega la solución de parada y las DO de los pozos se miden individualmente en el lector ELISA. La cantidad de anticuerpos IgM contra el antígeno se puede determinar dibujando un gráfico como se describió anteriormente.

Se puede adoptar un procedimiento similar para detectar anticuerpos IgG contra un antígeno.

Las enzimas comúnmente utilizadas en las técnicas ELISA son la peroxidasa de rábano picante y la fosfatasa alcalina (tabla 27.3). Estas enzimas están acopladas covalentemente a mAbs. Estas enzimas actúan sobre una variedad de sustratos para producir productos coloreados. Dado que el último paso del método ELISA es enzimático, el método ELISA es extremadamente sensible (es decir, son detectables concentraciones muy bajas de antígeno o anticuerpo).

La sensibilidad de los ensayos ELISA se incrementa mediante el uso de reactivos adicionales (por ejemplo, biotina / avidininmunoensayo). Recientemente, el uso de sustratos de peroxidasa de rábano picante que producen productos quimioluminiscentes ha mejorado aún más la sensibilidad. La medición de la velocidad de la reacción, en lugar de la extensión de la reacción en un solo instante fijo, proporciona resultados de ELISA cuantitativos más precisos.

Tabla 27.3: Características de las enzimas utilizadas en los inmunoensayos enzimáticos:

Caracteristicas

Peroxidasa de rábano picante

β-galactosidasa

Fosfatasa alcalina

Fuente

Rábano picante

Escherichia coli

Intestino bovino

MW (daltons)

Ca.40, 000

Ca.530, 000

140, 000

Actividad específica

250U / mg

600 U / mg

1000 U / mg

Tasa de rotación

10, 000

318, 000

250, 000

Medición de la enzima

Colorimetría, fluorometría, luminometría.

Colorimetría, fluorometría, luminometría.

Colorimetría, fluorometría, luminometría.

Método de etiquetado enzimático

Oxidación del periodato

Método de dimaleimida, reactivo de reticulación.

Método del glutaraldehído, reticulación

Biotin-Avidin ELISA mejorado:

En lugar de marcar el mAb con una enzima, el MAb puede marcarse con biotina (vitamina B 12 ).

Luego se agrega avidina marcada con enzimas (un componente proteico de la clara de huevo).

La avidina se une a la biotina con una sensibilidad y afinidad muy altas. Posteriormente se añade el sustrato. El complejo enzimático (en el complejo mAb-biotina-avidina-enzima) actúa sobre el sustrato y produce un producto coloreado.

La mejora con biotina-avidina también se usa en ensayos de inmunofluorescencia.

Inmunoensayos de enzimas de micropartículas:

En lugar de recubrir los pocillos de la placa de microtitulación con antígenos o anticuerpos, se recubren pequeñas perlas (1 mm de diámetro) con antígeno o anticuerpo y se realizan los ensayos ELISA. Las micropartículas ofrecen un área de superficie mayor para el recubrimiento de antígeno o anticuerpo, de modo que se pueden recubrir concentraciones más altas de antígeno o anticuerpo, lo que ayuda a acortar el tiempo requerido para las reacciones de unión.

El inmunoensayo de enzimas fluorescentes es idéntico a otros EIA, excepto que usan sustratos fluorescentes. En el EIA fluorescente, el fluoróforo se genera por una reacción enzimática. Tras la excitación del fluoróforo en su longitud de onda óptima, se emite luz a una longitud de onda característica. Se mide la luz fluorescente emitida.

Fluoroinmunoensayo resuelto en el tiempo:

Este método necesita instrumentación especial y etiquetas fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. El marcador fluorescente utilizado en este ensayo muestra una fluorescencia retardada con un período de tiempo de 100 ns o más entre la excitación y la emisión. La mayoría de las sustancias responsables de la fluorescencia de fondo tienen un período de decaimiento corto. Por lo tanto, la medición de la señal de fluorescencia retardada reducirá los efectos de la fluorescencia de fondo.

Este propósito se logra con el uso de un fluorómetro especial de resolución temporal que produce un pulso de luz rápido que excita al fluoróforo. La fluorescencia se mide un poco después de la excitación. Por lo tanto, se puede eliminar el efecto de un fondo no específico, que generalmente decae en menos de 10 ns.

Los fluoróforos que exhiben fluorescencia retardada son:

yo. Derivados del pireno con un tiempo de decaimiento de casi 100 ns.

ii. Etiquetas de quelatos de metales de tierras raras [como el europio (Eu 3+ ), el samario (Sm 3+ ) y el terbio (Tb 3+ )] que tienen un tiempo de descomposición muy largo de aproximadamente 50 a 100 µs.

Inmunoensayo quimioluminiscente:

Los inmunoensayos quimioluminiscentes (CL-EIA) utilizan sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con diversas enzimas. La reacción de enzima-sustrato quimioluminiscente genera luz, similar a la bioluminiscencia. Los sistemas de EIA quimioluminiscentes son una mejora definitiva sobre los RIA en términos de sensibilidad, eficiencia de tiempo y simplicidad de procedimientos.

Los inmunoensayos de quimioluminiscencia utilizan moléculas generadoras de quimioluminiscencia como marcadores.

yo. Derivados del luminol

ii. Ésteres de acridinio

iii. Derivados del oxalato de nitrofenilo

iv. Rutenio tri-bipridilo con tripropilamina para la electroquimioluminiscencia

v. Básicamente, los métodos de ensayo no difieren de los RIA / FIA.