Prueba en el Dole para descubrir la capacidad de una bacteria para hidrolizar el triptófano de aminoácidos (con la figura)

¡En la Prueba Dole para averiguar la capacidad de una bacteria para hidrolizar el triptófano de aminoácidos!

Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar el aminoácido triptófano al indol, ya que pueden producir la enzima 'triptofanasa'.

El triptófano se hidroliza con la producción de indol, ácido pirúvico y amoníaco. El indol es detectado por el reactivo de color, paradimetilaminobenzaldehído (p-DMAB, es decir, el reactivo de Kovac), que produce un anillo rosa. El indol reacciona con p-DMAB para producir el compuesto 'compuesto violeta rojo quinoidal (tinte de rosindol)', que es de color rosa. El anillo se produce en la superficie, ya que el reactivo se prepara en alcohol amílico.

En la prueba de indol, la bacteria de prueba se cultiva en un medio de caldo que contiene triptófano. Si la bacteria tiene la capacidad de hidrolizar triptófano a indol, se forma un anillo rosado en la superficie del cultivo en caldo al agregar p-DMAB.

Materiales necesarios:

Tubos de ensayo, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente de eliminación, incubadora, caldo de triptona, reactivo de Kovac (paradimetilaminobenzaldehído), colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.

Procedimiento:

1. Los ingredientes del medio de caldo de triptona o su polvo preparado para 100 ml del caldo se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando. La triptona actúa como una fuente de triptófano. Por lo tanto, la adición de triptófano al caldo es opcional (Figura 7.3).

2. Su pH se determina utilizando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.5 utilizando 0.1N HC1 si es más o utilizando 0.1N NaOH si es menos. El matraz se calienta, si es necesario, para disolver los ingredientes por completo.

3. El caldo se distribuye en cinco tubos de ensayo (aproximadamente 5 ml cada uno), tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.

4. Los tubos de caldo se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.

5. Los tubos de caldo se dejan enfriar a temperatura ambiente.

6. Las bacterias de prueba se inoculan asépticamente, preferiblemente en una cámara de flujo laminar, en el caldo con la ayuda de un bucle de inoculación esterilizado sobre una llama Bunsen. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

7. Los tubos de caldo inoculados se incuban a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora.

8. El reactivo de color, para-dimetilaminobenzaldehído (p-DMAB) (es decir, el reactivo de Kovac) se coloca en los tubos de caldo (0, 5 ml cada uno) y se observa después de 1 minuto.

Alternativamente:

7. Las tiras de papel empapadas en ácido oxálico se colocan en la boca de los tubos de caldo inoculados, de modo que aproximadamente la mitad de las tiras de papel permanezcan dentro de los tubos sin tocar el caldo y la otra mitad permanezca en el exterior. Para esto, el papel de filtro se corta en tiras de aproximadamente 35 mm de largo y 5 mm de ancho. Las tiras se sumergen en una solución acuosa saturada de ácido oxálico y se secan antes de usarlas.

8. Los tubos de caldo inoculados se incuban a 37 ° C durante 48 horas en una incubadora.

Observaciones:

1. Anillo rosa producido:

Indol positivo (es decir, las bacterias pueden convertir triptófano a indol).

2. Anillo rosa no producido:

Indol negativo (es decir, las bacterias no pueden convertir triptófano a indol).

Alternativamente:

1. Color rosado producido en la tira de papel:

Indol positivo (es decir, las bacterias pueden convertir triptófano a indol).

2. Color rosa no producido en la tira de papel:

Indol negativo (es decir, las bacterias no pueden convertir triptófano a indol).