Prueba de desoxirribonucleasa en bacterias para descubrir sus habilidades para hidrolizar el ADN (con la figura)

Prueba de desoxirribonucleasa (prueba de ADNasa) en bacterias para descubrir sus habilidades para hidrolizar el ADN (con la figura)!

Principio:

Algunas bacterias tienen la capacidad de hidrolizar el ácido desoxirribonucleico (ADN) a oligonucleótidos, ya que pueden producir la enzima hidrolítica extracelular "desoxirribonucleasa" (DNasa).

Mientras que el ADN se precipita por el ácido clorhídrico que produce opacidad, sus productos finales hidrolizados, los oligonucleótidos, no se precipitan por el ácido clorhídrico, por lo que no producen tal opacidad; más bien producir transparencia.

En la prueba de ADNasa, las bacterias de prueba se cultivan en placas de agar que contienen ADN. Después de que las colonias de las bacterias son visibles, las placas se inundan con ácido clorhídrico. Si las bacterias tienen la capacidad de hidrolizar el ADN, sus colonias hidrolizan el ADN en el medio en las áreas que las rodean, mientras que el resto de las áreas de las placas contienen ADN no hidrolizado.

Como resultado, cuando se inunda con ácido clorhídrico, se forman zonas transparentes claras alrededor de las colonias, ya que los productos hidrolizados, los oligonucleótidos, formados alrededor de ellos, no forman precipitados con el ácido clorhídrico.

Por otro lado, el resto de las áreas de las placas se vuelven opacas, ya que el ADN no hidrolizado en estas áreas forma precipitados con el ácido clorhídrico. Si se usa toluidina azul en lugar de ácido clorhídrico, solo se produce un halo rosa en las colonias.

Materiales necesarios:

Placas de Petri, matraz cónico, tapones de algodón, bucle de inoculación, autoclave, mechero Bunsen, cámara de flujo laminar, recipiente, incubadora, agar DNasa, ácido clorhídrico IN (o toluidina azul al 0, 1%), colonias aisladas o cultivos puros de bacterias.

Procedimiento:

1. Se limpian dos placas de petri, se cubren con papel artesanal y se atan con hilo o banda de goma (Figura 7.23). Este paso, así como la esterilización de las placas de Petri en el paso 6, se omiten si las placas de Petri esterilizadas en horno se usan directamente.

2. Los ingredientes del medio de agar DNasa (que contiene ADN como componente principal) o su polvo listo para usar requerido para 100 ml del medio se pesan y se disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando.

3. Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.2 usando 0.1N HCI si es más o usando 0.1N NaOH si es menos.

4. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.

5. El matraz está tapado con algodón, cubierto con papel artesanal y atado con hilo o banda de goma.

6. Las dos placas de Petri y el matraz cónico que contienen medio de agar DNasa se esterilizan a 121 ° C (presión de 15 psi) durante 15 minutos en un autoclave.

7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se dejan enfriar durante algún tiempo, sin dejar que el medio se solidifique. El enfriamiento del medio evita la condensación y la acumulación de gotas de agua dentro de las placas. Si el medio ya ha sido preparado y solidificado durante el almacenamiento, debe licuarse calentándolo cuidadosamente hasta que se derrita por completo.

8. Para preparar las placas de agar DNasa, antes de que el medio de agar DNase esterilizado se enfríe y solidifique, en estado fundido caliente, se vierte asépticamente, preferiblemente dentro de una cámara de flujo laminar, en las dos placas petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada una), de modo que El medio fundido cubre completamente el fondo de las placas de Petri.

Luego, las placas se cubren con sus tapas y se dejan enfriar, para solidificar el medio en ellas. El vapor de agua que puede condensarse en la superficie interna de las placas y tapas se evapora manteniendo las placas y las tapas en posición invertida en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.

9. Cada placa está marcada en el lado inferior en cuatro cuartos.

10. La "inoculación puntual" de las bacterias de prueba se realiza de forma aséptica, preferiblemente dentro de una cámara de flujo laminar, en el centro de cada cuarto haciendo una mancha (o una pequeña muestra) de las bacterias con la ayuda de un bucle esterilizado por llama. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

11. Las placas inoculadas se incuban en posición invertida, de arriba a abajo, a 37 ° C durante 24 a 48 horas en una incubadora hasta que las colonias de las bacterias son visibles.

12. Las placas se inundan con una solución de ácido clorhídrico 1 N (o toluidina azul al 0, 1%).

Observaciones:

1. Zonas transparentes transparentes (o halo rosa) formadas alrededor de las colonias: DNasa positiva.

2. Zonas transparentes transparentes (o halo rosa) que no se forman alrededor de las colonias: DNasa negativa.