Métodos biológicos de evaluación de drogas

Cuando los métodos físicos o químicos de evaluación o la cantidad de muestra son muy inferiores, no son capaces de producir resultados satisfactorios en los medicamentos, los medicamentos se evalúan mediante métodos biológicos de evaluación. Estos métodos se realizan en animales vivos, aislando órganos y tejidos vivos, preparación de animales y microorganismos. Los métodos biológicos de evaluación que se realizan en un organismo vivo se denominan bioensayo o ensayo biológico.

El siguiente método se utiliza como:

1. Actividad antiinflamatoria de las drogas.

2. La actividad antipirética de las drogas.

3. Actividad antidiabética de las drogas.

4. Actividad analgésica de las drogas.

5. Actividad antiulcerosa de las drogas.

6. Actividad antihelmíntica de la droga: se realizan en gusanos de tierra.

7. Actividad cardíaca del fármaco: los glucósidos cardíacos se evalúan en ranas y palomas.

8. Métodos microbiológicos: las bacterias vivas, la levadura y los mohos se utilizan para analizar las vitaminas y para determinar la actividad de los antibióticos.

Actividad antiinflamatoria de la droga:

Método de edema de la pata:

Se utilizan ratas Sprague-Dawley macho o hembra con un peso corporal de entre 100 y 150 g. Los animales se mueren de hambre durante la noche. Para asegurar una hidratación uniforme, las ratas reciben 5 ml de agua por medio de un tubo estomacal (controles) o el medicamento de prueba se disuelve o suspende en el mismo volumen. Treinta minutos más tarde, las ratas se someten a una inyección subcutánea de 0, 05 ml de solución de carragenina al 1% en el lado plantar de la pata trasera izquierda. La pata está marcada con tinta al nivel del maléolo lateral y se sumerge en mercurio hasta esta marca.

El volumen de la pata se mide pletismográficamente inmediatamente después de la inyección, nuevamente 3 y 6 h, y finalmente 24 h después de la exposición. El aumento del volumen de la pata después de 3 o 6 h se calcula como porcentaje comparado con el volumen medido inmediatamente después de la inyección del agente irritante para cada animal.

Los animales tratados eficazmente muestran mucho menos edema. La diferencia de los valores promedio entre los animales tratados y los grupos de control se calcula para cada intervalo de tiempo y se evalúa estadísticamente. Las diferencias en los distintos intervalos de tiempo dan algunas pistas sobre la duración del efecto antiinflamatorio. Se ejecuta una curva de dosis-respuesta para los fármacos activos y se pueden determinar los valores de ED50.

Método del granuloma de algodón:

Se anestesian ratas Wister macho con un peso promedio de 200 g con éter. La piel de la espalda se afeita y se desinfecta con etanol al 70%. Se realiza una incisión en la región lumbar. Por un fórceps romo se forman túneles subcutáneos y se coloca una bolita de algodón esterilizada en ambos lados en la región escapular.

Los pellets están estandarizados para su uso en odontología con un peso de 20 mg o pellets formados a partir de algodón crudo, que producen una inflamación más pronunciada que el algodón blanqueado. Los animales se tratan durante 7 días por vía subcutánea u oral.

Luego, los animales se sacrifican, los gránulos se preparan y se secan hasta que el peso permanece constante. Se determina el peso seco neto, es decir, después de restar el peso de la bolita de algodón. Se calcula el peso promedio de los gránulos del grupo de control y del grupo de prueba. Se determina el porcentaje de cambio del peso del granuloma en relación con el grupo de control del vehículo.

Actividad antipirética de la droga:

Se pueden utilizar conejos de ambos sexos y de varias cepas con un peso corporal de entre 3 y 5 kg. Los animales se colocan en jaulas adecuadas y los termopares conectados con un registrador automático se introducen en el recto. Se permite que los animales se adapten a las jaulas durante 60 min.

Luego se inyectan por vía intravenosa 0, 2 ml / kg que contienen 0, 2 µg de lipopolisacárido en la oreja de conejo. Sesenta minutos más tarde, el compuesto de ensayo se administra por vía subcutánea u oral. La temperatura corporal se controla durante al menos 3 hrs.

Una disminución de la temperatura corporal durante al menos 0, 5 ° C durante más de 30 minutos en comparación con el valor de temperatura antes de la administración del compuesto de ensayo se considera un efecto positivo. Este resultado se ha encontrado después de 45 mg / kg de fenilbutazona subcutánea o de 2, 5 mg / kg de indometacina subcutánea.

Actividad antidiabética de los fármacos:

Diabetes inducida por estreptozotocina:

Las ratas Wister macho que pesan 150-220 g alimentados con una dieta estándar se inyectan con 60 mg / kg de estreptozotocina (Calbiochem) por vía intravenosa. Al igual que con alloxan, se observan tres fases de los cambios de glucosa en la sangre. Inicialmente, la glucosa en sangre aumenta, alcanzando valores de 150-200 mg% después de 3 h. Seis y ocho horas después de la estreptozotocina, los valores séricos de insulina aumentan hasta 4 veces, lo que resulta en una fase de hipoglucemia que es seguida por una hiperglucemia persistente. La gravedad y el inicio de los síntomas diabéticos dependen de la dosis de estreptozotocina.

Después de la dosis de 60 mg / kg por vía intravenosa. Los síntomas aparecen ya después de 24-48 h con hiperglucemia de hasta 800 mg%, glucosuria y cetonemia. Histológicamente, las células beta son degranuladas o incluso necróticas. Se alcanza un estado estable después de 10 a 14 días, lo que permite utilizar a los animales para pruebas farmacológicas.

Diabetes inducida por alloxan: se infunden conejos con un peso de 2.0 a 3.5 kg a través de la vena de la oreja con 150 mg / kg de aloxano monohidrato (5.0 g / 100 ml, pH 4.5) durante 10 minutos, lo que hace que el 70% de los animales se vuelvan hiperglucémicos y uricosúricos. El resto de los animales mueren o solo son temporalmente hiperglucémicos.

Actividad analgésica del fármaco:

Método de la placa caliente:

Se utilizan grupos de 10 ratones de ambos sexos con un peso inicial de 18 a 22 g para cada dosis. La placa caliente, que está disponible comercialmente, consiste en una superficie calentada eléctricamente. La temperatura se controla de 55 ° a 56 ° C. Esto puede ser una placa de cobre o una superficie de vidrio caliente. Los animales se colocan en la placa calefactora y el tiempo hasta que se produce el lamido o el salto se registra mediante un cronómetro. La latencia se registra antes y después de 20, 60 y 90 minutos después de la administración oral o subcutánea del estándar o del compuesto de prueba.

Prueba de inmersión en la cola:

Se utilizan ratas Wister hembras jóvenes (170-210 g de peso corporal). Se colocan en jaulas de restricción individuales, dejando la cola colgando libremente. Se permite que los animales se adapten a las jaulas durante 30 minutos antes del ensayo. La porción inferior de 5 cm de la cola está marcada. Esta parte de la cola se sumerge en una taza de agua recién llenada de exactamente 55 ° C. En pocos segundos la rata reacciona retirando la cola. El tiempo de reacción se registra en unidades de 0, 5 s por un cronómetro. Después de cada determinación, la cola se seca cuidadosamente.

El tiempo de reacción se determina antes y periódicamente después de la administración oral o subcutánea de la sustancia de ensayo, por ejemplo, después de 0, 5, 1, 2, 3, 4 y 6 h. El tiempo de corte de la inmersión es de 15 s. El tiempo de espera de los animales no tratados es de entre 1 y 5, 5 s. Un tiempo de retiro de más de 6 s, por lo tanto, se considera una respuesta positiva.

Método de clip de la cola de Heffner:

Se aplica un clip de arteria a la raíz de la cola de los ratones y se anota el tiempo de reacción. Se utilizan ratones machos (cepa Charles River u otras cepas) con un peso entre 18 y 25 g. El grupo de control consiste en 10 ratones. Los compuestos de ensayo se administran por vía subcutánea a ratones alimentados o por vía oral a animales en ayunas. Los grupos de prueba y el grupo de control consisten en 7-10 ratones.

El medicamento se administra 15, 30 o 60 minutos antes de la prueba. Se aplica un clip de arteria a la raíz de la cola (aproximadamente a 1 cm del cuerpo) para inducir dolor. El animal responde rápidamente a este estímulo nocivo mordiendo el clip o la cola cerca de la ubicación del clip. El tiempo entre el inicio de la estimulación y la respuesta se mide con un cronómetro en incrementos de 1/10 segundos.

Actividad antiulcerosa :

Ligadura del píloro en ratas (rata shay):

Las ratas Wister hembras que pesan 150-170 g se mueren de hambre durante 48 h y tienen acceso a agua potable ad libitum. Durante este tiempo se alojan solos en jaulas con fondos elevados de malla de alambre ancha para evitar el canibalismo y la coprofagia. Se utilizan diez animales por dosis y como controles. Bajo anestesia con éter se realiza una incisión abdominal en la línea media. El píloro está legado, cuidando que no se dañe la sangre.

No hay suministro o tracción en el píloro. Agarrar el estómago con instrumentos se debe evitar meticulosamente; de lo contrario, la ulceración se desarrollará invariablemente en tales puntos. La pared abdominal está cerrada por suturas. Los compuestos de ensayo se administran por vía oral por sonda o se inyectan por vía subcutánea.

Los animales se colocan durante 19 h en cilindros de plástico con un diámetro interno de 45 mm que se cierra en ambos extremos con una malla de alambre. Posteriormente, los animales son sacrificados en anestesia con CO ₂ . Se abre el abdomen y se coloca una ligadura alrededor del esófago cerca del diafragma.

Se extrae el estómago y el contenido se drena en un tubo de centrífuga. A lo largo de la curvatura mayor, el estómago se abre y se sujeta sobre una placa de corcho. La mucosa se examina con un microscopio estéreo. En la rata, las dos quintas partes superiores del estómago forman el rumen con epitelio escamoso y poseen pocos mecanismos de protección contra la acción corrosiva del jugo gástrico.

Debajo de una cresta limitante, en la porción glandular del estómago, los mecanismos de protección son mejores en la mucosa del medio, dos quintas partes del estómago que en la parte más baja, formando el antro.

Por lo tanto, las lesiones se presentan principalmente en el rumen y en el antro. Se anota el número de úlceras y se registra la gravedad con las siguientes puntuaciones:

. 0 = sin úlcera

. 1 = úlceras superficiales

. 2 = úlceras profundas

. 3 = perforación.

Se mide el volumen del contenido gástrico. Después de la centrifugación, la acidez se determina por titulación con 0, 1 n de NaOH.

Evaluación:

Se calcula una IU de índice de úlcera:

UI = UN + US + UP x 10-1

yo. UN = promedio del número de úlceras por animal

ii. EE. UU. = Promedio de la puntuación de gravedad

iii. UP = porcentaje de animales con úlceras

El índice de úlcera y la acidez del contenido gástrico de los animales tratados se comparan con los controles. Usando varias dosis, se pueden establecer curvas dosis-respuesta para la formación de úlceras y la secreción de ácido gástrico. Los valores de ID50 se pueden calcular por análisis de probidad, donde 0% corresponde a no y 100% a la producción máxima de ácido gástrico estimulada.

Úlcera por estrés por inmovilización:

Se utilizan grupos de 10 ratas Wister hembras por dosis de fármaco de prueba y para controles que pesan 150-170 g. La comida y el agua se retiran 24h antes del experimento. Después de la administración oral o subcutánea del compuesto de ensayo o la solución de placebo, los animales se anestesian ligeramente con éter.

Las extremidades inferiores y superiores se fijan juntas y los animales se envuelven en una mirada de alambre. Se suspenden horizontalmente en la oscuridad a 20 ° C durante 24 h y finalmente se sacrifican en anestesia con CO ₂ . Se extrae el estómago, se fija en una placa de corcho y se registra el número y la gravedad de las úlceras con un microscopio estereoscópico utilizando las siguientes puntuaciones:

.0 = sin úlcera

.1 = úlceras superficiales

.2 = úlceras profundas.

.3 = perforación

Evaluación

Se calcula una IU de índice de úlcera:

UI = UN + US + UP x 10-1

ONU: promedio del número de úlceras por animal.

EE. UU. = Promedio de la puntuación de gravedad.

UP - porcentaje de animales con úlceras