Bacterias presentes en una muestra mediante el método de placa de agar de dilución en serie o el método de recuento total de placas (TPC)

Recuento total de placas (TPC):

Para enumerar las bacterias presentes en una muestra mediante el método de placa de agar por dilución en serie o el método de conteo de placa total (TPC).

Propósito:

El alcance de la actividad bacteriana en una muestra dada en un conjunto definido de condiciones depende principalmente del número total de bacterias presentes en ella, independientemente de su especie.

Por lo tanto, a menudo se requiere averiguar el número total de bacterias presentes en muestras de alimentos, agua, suelo, aire y tejido durante su análisis microbiológico. Este número total de bacterias incluye bacterias vivas y muertas ". Las bacterias muertas no pueden crecer y reproducirse.

Solo las bacterias vivas (bacterias viables) pueden crecer y multiplicarse dando como resultado una actividad bacteriana específica. Por lo tanto, con mucha frecuencia se requiere enumerar las células bacterianas viables en diferentes muestras. Sin embargo, la mayoría de los métodos de enumeración como el recuento microscópico directo, el recuento electrónico de células, los métodos químicos y el método espectrofotométrico cuentan tanto con células vivas como con células muertas.

Estos métodos no pueden discriminar entre células vivas y muertas. Por lo tanto, el método de placa de dilución en serie de agar, que enumera solo las células de bacterias viables, es el método universalmente utilizado para contar las células vivas en diferentes muestras.

Principio:

Un peso definido de muestra sólida se homogeneiza asépticamente en nueve volúmenes de solución salina estéril para obtener una suspensión homogénea de bacterias. La muestra líquida se utiliza directamente como suspensión homogénea de bacterias. Las suspensiones de bacterias así obtenidas se diluyen en serie (10 veces, 100 veces, 1000 veces, etc.). Aquí 10 -1, 10 -2, 10 -3 etc. se llaman diluciones.

Sus recíprocos (10 1, 10 2, 10 3, etc.) se denominan factores de dilución. Un volumen definido de la suspensión de bacterias de cada dilución se inocula en placas de agar y se propaga adecuadamente, para separar las células bacterianas individuales y aislarlas entre sí.

La inoculación de bacterias para su enumeración se realiza en dos técnicas de la siguiente manera:

1. Vierta la técnica del plato.

2. Difundir la técnica del plato.

1. Vierta la técnica de la placa:

En esta técnica, 1 ml de la suspensión de bacterias se coloca en una placa de Petri esterilizada y luego se vierte sobre ella un medio de agar nutritivo y licuado. La placa de Petri se gira suavemente, para permitir que la suspensión se mezcle con el medio de manera uniforme. Se deja enfriar y solidificar.

2. Técnica de la placa de propagación:

En esta técnica, se dejan caer 0, 1 ml de la suspensión de bacterias sobre una placa de agar preparada. Luego, la gota de suspensión se extiende uniformemente sobre la placa de agar por un esparcidor de vidrio esterilizado.

Para minimizar el error, cada suspensión diluida se coloca en 2 a 5 placas duplicadas. Las placas inoculadas se incuban a 37 ° C durante 24 horas. Durante este período, cada célula bacteriana individual aislada en la placa de agar crece y se multiplica rápidamente para producir una masa macroscópica visible de células bacterianas llamada "colonia". Por lo tanto, el número de colonias en la placa representa el número de bacterias en la muestra.

Sin embargo, muy a menudo, durante la propagación, es posible que algunas células no se separen adecuadamente y que pocas de estas células no separadas puedan dar lugar a una única colonia. Además, pocas células tienen tendencia a permanecer en pares, cadenas o grupos.

Aquí, cada par, cadena o grupo produce una colonia. Por lo tanto, cada colonia, en sentido estricto, no representa una sola bacteria. Por eso, en lugar de expresar los conteos de bacterias como 'No. de bacterias / gm o ml de muestra ', se expresa muy a menudo como el número de unidades formadoras de colonias por gm o ml (CFU / gm o ml).

El recuento total de placas (TPC) en la muestra original se calcula multiplicando el número de CPU con los factores de dilución respectivos. Se siguen las "reglas de enumeración", mientras se calcula el número de bacterias en la muestra original.

Materiales necesarios:

Placas de Petri (15 nn.), Pipetas de 2 ml (10 nn.), Pipeta de 10 ml (1 n. °), tubos de ensayo (10 n. °), matraces cónicos (500 ml y 1 litro-1 n. Cada uno), Vaso de precipitados de 500 ml (2 nn.), Esparcidor de vidrio, estuche para pipetas de acero inoxidable, papel para manualidades, hilo (o banda elástica), algodón no absorbente, alcohol etílico, cloruro de sodio (NaCl), ácido clorhídrico 0.1N (HCI), Hidróxido de sodio 0.1N (NaOH), agua destilada, agar nutriente, muestra líquida (por ejemplo, agua de estanque / aguas residuales), muestra sólida (por ejemplo, suelo / carne de pescado / carne de ostra / alimento procesado), papel de pH (o medidor de pH), mano de mortero y mortero (u homogenizador), mechero Bunsen, horno de aire caliente, autoclave, incubadora, cámara de flujo laminar, contador de colonias de Quebec.

Procedimiento:

1. Diez pipetas (en una caja de pipetas de acero inoxidable), 15 placas de Petri y un par de mortero y mortero (o una taza de homogeneizador) se esterilizan en un horno de aire caliente a 180 ° C durante 3 horas. Alternativamente, se pueden cubrir con papel para manualidades, atar con hilo o banda de goma y esterilizar en autoclave junto con el medio (Figura 6.6).

El número de placas de Petri y, por consiguiente, la cantidad de medio a utilizar se calcula en función del número de repeticiones y diluciones requeridas. Aquí, la cristalería y el medio se han tomado para replicación única y dilución hasta 10 -6 . La cantidad de material de vidrio y la cantidad de medio tomado para la esterilización es un poco más para evitar cualquier error incidental, ya que la esterilización es un proceso largo.

2. Se disuelven 4, 25 g de NaCl en 500 ml de agua destilada para obtener una solución salina fisiológica (0, 85%). 225 ml de esta solución salina se vierten en un matraz cónico de 500 ml. Su boca está tapada con algodón, cubierta con papel artesanal y atada con hilo o banda elástica. Se utiliza como los primeros diluyentes para diluir la muestra sólida.

3. Se pipetean 9, 0 ml de la solución salina sobrante en cada uno de los 10 tubos de ensayo. Sus bocas están tapadas con algodón, cubiertas con papel artesanal y atadas con hilo o banda elástica. Estos se utilizan como diluyentes para dilución en serie.

4. Los ingredientes del medio de agar nutriente o su polvo listo para usar requerido para 500 ml del medio se pesan y se disuelven en 500 ml de agua destilada en un matraz cónico de 1 litro agitando y agitando.

Su pH se determina usando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.0 usando 0.1N HCl si es más o usando 0.1 N NaOH si es menos. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente. Luego, se tapa con algodón, se cubre con papel artesanal y se ata con hilo o banda de goma.

5. El matraz cónico de 500 ml que contiene 225 ml de solución salina, los 10 tubos de ensayo que contienen 9 ml de solución salina cada uno y el matraz cónico de 1 litro que contiene 500 ml de medio de agar nutriente se esterilizan a 121 ° C (presión de 15 psi) durante 15 minutos en un autoclave.

6. Después de la esterilización, los materiales esterilizados se retiran del autoclave y se dejan enfriar durante algún tiempo, sin permitir que el medio se solidifique. El enfriamiento del medio evita la condensación y la acumulación de gotas de agua dentro de las placas. Si el medio ya ha sido preparado y solidificado durante el almacenamiento, debe licuarse calentándolo cuidadosamente hasta que se derrita por completo.

7. Para preparar placas de agar, antes de que el medio de agar nutriente y esterilizado se enfríe y solidifique, en estado fundido caliente, se vierte asépticamente en las 6 placas de petri esterilizadas (aproximadamente 20 ml cada una), de modo que el medio fundido cubra el fondo del petri. platos por completo.

Luego, las placas se cubren con sus tapas y se dejan enfriar, para solidificar el medio en ellas. El vapor de agua que puede condensarse en la superficie interna de las placas y tapas se evapora manteniendo las placas y las tapas en posición invertida en una incubadora a 37 ° C durante aproximadamente 1 hora.

8. 25 g de la muestra sólida (p. Ej. Carne de pescado / carne de ostra / alimento procesado) se pesa y se homogeneiza en 225 ml de solución salina esterilizada (diluyente) asépticamente (Figura 6.7). Esto da una dilución 10 veces (dilución = 10 -1 ). Para la muestra líquida, se pipetea asépticamente 1 ml de muestra en un tubo de solución salina esterilizada de 9 ml. Esto también da una dilución 10 veces (dilución = 10 -1 ).

9. 1 ml de la dilución 10 -1 se transfiere a 9 ml de solución salina esterilizada en otro tubo de ensayo. Esto da 100 veces la dilución (dilución = 10 -2 ). A partir de la dilución 10 -2, se deposita 1 ml en una placa petri esterilizada y 0, 1 ml en una placa de agar, desde la misma pipeta. Para cada dilución se utiliza una pipeta esterilizada por separado. Después de su uso se sumerge en el frasco desechable.

10. 1 ml de la dilución 10 -2 se transfiere a 9 ml de solución salina esterilizada en otro tubo de ensayo. Esto da 1000 veces la dilución (dilución = 10 -3 ). De la dilución 10 -3, 1 ml se vierte en una placa petri esterilizada y 0, 1 ml en una placa de agar, de la misma pipeta. De manera similar, la dilución se continúa hasta 10 -6 en serie, cada vez transfiriendo 1 ml a una placa de Petri esterilizada y 0, 1 ml a una placa de agar de la misma pipeta.

11. Luego, las gotas de suspensión en las placas de agar se extienden asépticamente por un esparcidor de vidrio esterilizado. Después de extenderse en cada placa, se esteriliza con una llama sumergiéndola en alcohol y mostrándola sobre una llama. Esta es la 'técnica de la placa de propagación'.

12. Las placas de Petri que contienen 1 ml de suspensión de bacterias se toman cada una y se vierte en ellas un agar nutritivo y licuado. Se hacen girar suavemente para permitir que la suspensión se mezcle con el medio de manera uniforme. Las placas se dejan enfriar hasta que el medio se solidifica. Esta es la técnica de la placa de verter.

13. Luego, las placas se incuban en posición invertida, de arriba abajo, a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora (Figura 6.7).

14. Se incuba una placa de agar no inoculada como control para asegurar una esterilización adecuada, como se muestra sin crecimiento en ella.

Observaciones:

El número de colonias de bacterias en las placas se cuenta directamente o con la ayuda de un contador de colonias de Quebec. A partir de esto, se calcula el número de bacterias presentes por gramo o ml de la muestra original. Esto se llama enumeración.

Reglas de enumeración:

1. Se deben considerar las placas de Petri con 30 a 300 colonias.

2. Los números promedio de duplicados y triplicados (R 1, R 2 R 3 ...) se consideran solo si un conteo no es más del doble del otro. Si uno es más del doble del otro valor inferior se toma.

3. Para la técnica de placa de vertido, el recuento de bacterias es el Nº X 10 c / g, donde c = factor de dilución. Para la técnica de placa de extensión, el recuento de bacterias es el Nº X10 c + 1 / g, donde c = factor de dilución. El número se convierte a dos lugares decimales en forma de (x.yz X 10 m ). Por ejemplo, 288 X 10 4 se expresa como 2, 88 X 10 6 .

4. Si, en todas las diluciones, el número de colonias es más de 300, cuente para la dilución más alta y si en todas las diluciones es menos de 30, se considera la dilución más baja. En ambos casos, el recuento se representa como: Nº X 10 c / g / ml estimado para la técnica de placa de vertido y Nº X 10 c + 1 / g / ml Estimado para la técnica de placa extendida.

5. Si no se observa ninguna colonia en cualquier dilución tomada, se representa como: Estimado <1 x la dilución más baja.

6. Como la dilución en serie se realiza en términos de 10 veces, matemáticamente es obvio que no hay dos diluciones que puedan tener colonias entre 30 y 300. Por ejemplo, si 10 -3 tiene 50 colonias, 10 -2 deberían tener 500 (es decir, > 300) y 10 -4 deberían tener 5 (es decir, <30) colonias.

Sin embargo, esto no ocurre en la realidad, ya que las bacterias no se presentan como una solución homogénea; Más bien se producen como una suspensión en los diluyentes. Si hay dos diluciones que tienen colonias contables (entre 30 y 300), primero calcule el número de unidades formadoras de colonias / gm / ml utilizando cada dilución.

Si un valor es más del doble del otro, informe el valor más bajo. Si no, tome el promedio de los dos valores e informe ese valor.