Trate de aislar diferentes bacterias presentes en una muestra dada y mantener sus culturas puras

Trate de aislar diferentes bacterias presentes en una muestra dada y mantener sus cultivos puros.

Propósito:

Las bacterias que se encuentran en la naturaleza, no aparecen como especies segregadas, sino que aparecen como poblaciones mixtas de diferentes especies.

Por lo tanto, para estudiar las especies individuales de bacterias, primero se requiere separarlas de la población mixta. Este proceso se llama 'aislamiento de bacterias'.

Se logra haciendo crecer la población mixta de bacterias en la superficie de un medio sólido en colonias discretas. Las "colonias" son masas individuales y macroscópicamente visibles de bacterias que crecen en la superficie de un medio sólido, cada una de las cuales representa la multiplicación de una sola bacteria.

Como cada colonia proviene del crecimiento y la multiplicación repetida de una sola bacteria, todas las bacterias presentes en la colonia pertenecen a la misma especie. Por lo tanto, cada colonia representa una población muy grande de una sola especie de bacteria.

Estas colonias se transfieren asépticamente a inclinaciones de agar nutrientes separadas y se dejan crecer allí. Las especies aisladas de bacterias, cultivadas por separado en inclinaciones de agar, se llaman "cultivos puros". Cada 15 a 30 días, se transfieren a slants frescos, para que no pierdan sus características originales debido al exceso de gente, la falta de nutrientes y la acumulación de metabolitos.

De esta manera, los cultivos puros de bacterias se mantienen en el laboratorio mediante transferencia repetida a inclinaciones recientes a intervalos regulares. Este proceso se conoce como 'mantenimiento de la cultura pura'. Los cultivos puros se mantienen en el laboratorio para su posterior identificación mediante diversas técnicas de tinción, bioquímicas, serológicas y moleculares, así como para su uso futuro.

Las 'culturas de stock' son culturas puras estándar, cuya identificación se ha establecido internacionalmente a nivel de género, especie, subespecie, tipo o subtipo. Se mantienen en laboratorios de microbiología reconocidos internacionalmente.

Otros laboratorios pueden obtenerlos de estos laboratorios y mantenerlos en sus propios laboratorios como cultivos de reserva, mediante la transferencia repetida a inclinaciones recientes a intervalos regulares. Se utilizan para la identificación confirmada de cultivos puros obtenidos en estos laboratorios mediante la comparación de sus características con las de los cultivos estándar.

Principio:

La población mixta de bacterias presentes en un material dado (sólido, líquido o superficie) se cultiva en placas de agar nutritivo mediante el método de placa de separación o placa de separación como se describe anteriormente en "Cultivo de bacterias". Cada colonia aislada que se encuentra en una placa de agar consiste en una especie de bacteria, ya que cada colonia crece a partir de una sola bacteria.

Por lo tanto, las bacterias se aíslan en placas de agar mediante dos técnicas como sigue:

(a) Técnica de placa de extensión.

(b) Técnica de la placa de rayas.

Se seleccionan colonias representativas (colonias que tienen características diferentes) y se inoculan asépticamente para separar las inclinaciones de agar para obtener los cultivos puros. Después de cada 15 a 30 días, se transfieren a slants frescos para el mantenimiento de estos cultivos puros.

Materiales necesarios:

Tubos de ensayo (5 nn.), Matraz cónico de 250 ml (1 no), NaOH 0.1N, HCl 0.1N, agua destilada, agar nutriente, algodón no absorbente, asa, papel para manualidades, hilo (o banda de goma), papel de pH (o medidor de pH), mechero Bunsen, autoclave, cámara de flujo laminar, incubadora, placas que contienen colonias aisladas de bacterias (placa de distribución o placa de separación).

Procedimiento:

1. Los ingredientes del medio de agar nutriente o su polvo listo para su uso requerido para 100 ml del medio se pesan y disuelven en 100 ml de agua destilada en un matraz cónico de 250 ml agitando y agitando (Figura 6.4).

2. Su pH se determina utilizando un papel de pH o un medidor de pH y se ajusta a 7.0 utilizando 0.1N HC1 si es más o utilizando 0.1N NaOH si es menos.

3. El matraz se calienta para disolver el agar en el medio completamente.

4. Antes de que se solidifique, el medio en estado fundido caliente se distribuye en 5 tubos de ensayo (aproximadamente 20 ml cada uno).

5. Los tubos de ensayo están tapados con algodón, cubiertos con papel artesanal y atados con hilo o banda de goma.

6. Se esterilizan a 121 ° C (15 psi de presión) durante 15 minutos en un autoclave.

7. Después de la esterilización, se retiran del autoclave y se mantienen en una posición inclinada para enfriar y solidificar el medio. Estos tubos de ensayo que contienen medio de agar nutriente solidificado en condición inclinada se denominan "inclinaciones de agar nutriente".

8. Los pasos 10 y 11 deben realizarse siguiendo una técnica aséptica, preferiblemente en una cámara de flujo laminar. La boca de los recipientes que contienen medios o cultivos esterilizados debe mostrarse sobre el mechero Bunsen después de quitar el tapón de algodón y antes de volver a colocarlo.

Los bucles, antes del uso, deben esterilizarse a la llama calentando a rojo vivo y luego enfriándose durante 30 segundos para enfriarlos a temperatura ambiente. Nunca deben usarse cuando están muy calientes, ya que matan a los microbios cuando los tocan.

9. En el experimento anterior, si se pudieran observar colonias aisladas en la placa esparcida o en la placa de vetas, se seleccionan cinco colonias con características diferentes como colonias representativas.

10. Se esteriliza un bucle a la llama y se toma asépticamente un bucle de bacterias de cada una de las colonias representativas. El bucle se introduce en la inclinación del agar, de modo que el bucle de bacterias llega al final de la inclinación. El bucle se mueve hacia afuera de manera ondulada tocando la superficie de la inclinación, de manera que se forma una línea ondulada.

11. El bucle se esteriliza a la llama y, de manera similar, el resto de las cuatro colonias representativas se inoculan por separado en la izquierda en cuatro inclinaciones. El bucle se esteriliza después de cada inoculación.

12. Los cinco sesgos inoculados se incuban a 37 ° C durante 24 horas en una incubadora.

Observaciones (Características Culturales):

(i) Una línea ondulada con crecimiento a lo largo de su longitud observada:

El crecimiento ha tenido lugar.

La inclinación se observa para las características de inclinación de la siguiente manera (Figura 6.5).

1. Abundancia de crecimiento:

La cantidad de crecimiento se designa como ninguna, ligera, moderada o grande.

2. Pigmentación:

Los microorganismos cromogénicos pueden producir pigmentos intracelulares que son responsables de la coloración del organismo como se ve en las colonias de superficie. Otros organismos producen pigmentos solubles extracelulares que se excretan en el medio y también producen un color. La mayoría de los organismos, sin embargo, no son cromoméricos y aparecerán de blanco a gris.

3. Características ópticas:

Las características ópticas se pueden evaluar en función de la cantidad de luz transmitida a través del crecimiento.

Estas características se describen como:

(una) Opaco: No hay transmisión de luz.

(segundo) Translúcido: transmisión parcial de la luz.

(do) Transparente: transmisión de luz completa.

4. Forma:

La aparición de la línea de crecimiento de una sola línea en la superficie de agar se designa de la siguiente manera:

(una) Filiforme: Crecimiento continuo, similar a un hilo con bordes lisos.

(segundo) Echinulado: Crecimiento continuo, similar a un hilo con bordes irregulares.

(do) Con cuentas: no confluente a las colonias semi-confluentes.

(re) Effuse: Crecimiento fino, esparcido.

(mi) Arborescente: crecimiento arbóreo.

(f) Rhizoide: crecimiento similar a una raíz.

(ii) No hay crecimiento a lo largo de la línea de inoculación:

Técnica defectuosa de inoculación, se repite la inoculación. C Enumeración de bacterias.

C. Enumeración de Bacterias:

El alcance de la actividad bacteriana en una muestra dada en un conjunto definido de condiciones depende principalmente del número total de bacterias presentes en ella, independientemente de su especie. Por lo tanto, a menudo se requiere averiguar el número total de bacterias presentes en muestras de alimentos, agua, suelo, aire y tejido durante su análisis microbiológico.

La estimación del número de bacterias en una muestra dada se denomina "enumeración de bacterias". Hay varios métodos de enumeración de bacterias como se indica a continuación. Todos estos métodos necesitan que las bacterias estén presentes en una suspensión homogénea.

Es por eso que se supone que las muestras líquidas son suspensiones homogéneas de bacterias y se usan directamente, mientras que las muestras sólidas se homogeneizan en soluciones salinas estériles, para obtener suspensiones homogéneas de bacterias.

No se usa comúnmente:

(I) Métodos directos:

(a) Conteo microscópico directo.

(b) Contador electrónico de células.

(II) Métodos indirectos:

(re) Método turbidimétrico

(mi) Recuento de filtro de membrana

Más ampliamente usado:

(f) Método de placa de dilución en serie en agar o Método de conteo de placa total (método TPC)

(a) Conteo microscópico directo:

En este método, el número de bacterias presentes en una parte alícuota de la suspensión homogénea de bacterias se cuenta directamente con un microscopio y el número total de bacterias en la muestra se determina matemáticamente.

La ventaja de este método es que es muy rápido. Las desventajas son que, tanto las células vivas (viables) como las células muertas se cuentan y el método no es sensible a poblaciones de menos de un millón de bacterias por mililitro.

El conteo se puede hacer en dos métodos de la siguiente manera:

(i) Cámara de Petroff-Hauser:

Es una cámara de recuento especializada, en la que se coloca una parte alícuota de la suspensión homogénea de bacterias para el recuento directamente bajo un microscopio.

(ii) Cría de frotis:

Las células bacterianas se cuentan directamente al microscopio utilizando frotis teñidos confinados en un área de 1 mm ² en el portaobjetos. Se utiliza principalmente para la enumeración de bacterias en la leche.

(b) Contador electrónico de células:

Se utiliza un contador electrónico de células como 'Contador de Coulter' para contar directamente el número de células bacterianas. Una suspensión homogénea de células bacterianas preparadas en un fluido conductor se deja pasar a través de un orificio diminuto, a través del cual fluye una corriente eléctrica.

La resistencia en el orificio se registra electrónicamente. Cuando una célula pasa a través del orificio, al no ser conductor, aumenta la resistencia momentáneamente. El número de veces que la resistencia aumenta momentáneamente se registra electrónicamente, lo que indica el número de bacterias presentes en la suspensión.

La ventaja de este método es que es extremadamente rápido. Las desventajas son que, tanto las células vivas (viables) como las células muertas se cuentan y el instrumento no puede distinguir entre las células bacterianas y las partículas inertes.

(c) Métodos químicos:

Estos métodos estiman la cantidad de esas sustancias, principalmente sustancias químicas, que aumenta con el aumento de la población bacteriana.

Los principales parámetros estimados son los siguientes:

(i) Concentración de proteínas

(ii) concentración de ADN

(iii) Peso seco

(iv) Producción de dióxido de carbono.

(v) la captación de oxígeno

(vi) Producción de ácido láctico.

(d) Método turbidimétrico:

Cuando las bacterias se cultivan en medios líquidos ricos en nutrientes (por ejemplo, caldo de nutrientes), su crecimiento profuso hace que los medios se vuelvan turbios, ya que las células de las bacterias en su mayoría permanecen suspendidas en ellos. La turbidez aumenta con el aumento del número de células en los medios. A medida que aumenta la turbidez, aumenta la "absorbancia" o la "densidad óptica (OD)" de los medios.

La OD de la suspensión de células bacterianas en el medio se mide utilizando un espectrofotómetro a 600 nm. El número de células bacterianas en la suspensión se encuentra comparando la DO con una curva estándar preparada trazando los valores de OD para diferentes concentraciones conocidas de bacterias. El método es rápido, pero se limita a suspensiones bacterianas de más de 10 millones de células.

(e) Recuento de filtro de membrana:

Este método se utiliza cuando el número de bacterias en una muestra líquida es muy inferior. Para aumentar la concentración de bacterias, primero se filtra asépticamente la muestra líquida a través de un aparato de filtro de membrana esterilizado utilizando un filtro de membrana estéril.

El filtro de membrana que contiene las bacterias atrapadas se transfiere asépticamente a una placa de Petri estéril que contiene una almohadilla absorbente saturada con un medio líquido diferencial selectivo. El medio rezuma sobre la superficie del filtro. Después de la incubación, el número de colonias formadas en el filtro se cuenta utilizando un simple microscopio.